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《H7N9亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立-論文.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展。2013，34(12)：1-5ProgressinVeterinaryMedicineH7N9亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR檢測(cè)方法的建立羅思思，謝芝勛卜，劉加波，陳敏玫。，楊進(jìn)業(yè)，鄧顯文，謝志勤，龐耀珊，謝麗基，范晴(1．廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001；2．廣西壯族自治區(qū)疾病控制中心，廣西南寧530028)摘要：根據(jù)H7N9亞型禽流感病毒(AIV)HA基因和NA基因的保守序列，分別設(shè)計(jì)特異性引物和不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的TaqMan探針。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了HTN9亞型AIV的5bL重實(shí)
2、時(shí)熒光定量RT—PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該法檢測(cè)H7N9亞型AIV的下限為10copies／L，批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)變異系數(shù)均小于3％。本研究建立的H7N9亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR方法，具有快速、特異和敏感的優(yōu)點(diǎn)，可為H7'N9亞型AIV的有效防控提供技術(shù)支撐。關(guān)鍵詞：禽流感病毒；H7N9；實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR中圖分類號(hào)：$852．659．5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007—5038(2013)12—0001—05禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)屬于衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)3月31日通報(bào)，上海、安徽正黏病毒科A型
3、流感病毒屬，根據(jù)表面糖蛋白血凝發(fā)生3人感染H7N9禽流感確診病例，2例上?；妓?hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuramini—者已死亡。自2002年以來，全球報(bào)道的人感染H7dase，NA)的抗原性差異，AIV可進(jìn)一步分為不同亞型AIV病例超過100人，臨床表現(xiàn)由結(jié)膜炎至輕的亞型，目前已鑒別出16種HA(H1～H16)和9種微的上呼吸道疾病甚至是肺炎[4]。H7N9亞型AIVNA(N1～N9)c1]。AIV是一種有囊膜、單股負(fù)鏈、以往僅在禽間發(fā)現(xiàn)，在荷蘭、日本及美國等地曾暴發(fā)分節(jié)段的RNA病毒，基因組分為8個(gè)節(jié)段，分別編過禽間疫情，
4、但從未發(fā)現(xiàn)過人的感染情況。此次人碼HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白口]。感染H7N9亞型AIV，是全球首次發(fā)現(xiàn)的新亞型流由于禽流感病毒基因組分節(jié)段的特征，AIV較感病毒。截至2013年5月29日，全國已確診易發(fā)生變異，主要有抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換兩種方式。H7N9亞型AIV感染131人，其中37人死亡，76人前者由于聚合酶保真性較低，在病毒復(fù)制過程中，痊愈。HA和NA基因有可能逐步發(fā)生核苷酸點(diǎn)突變，不針對(duì)以上現(xiàn)狀和目前的情勢(shì)，急需建立H7N9斷積累可使表面抗原發(fā)生顯著的變化，產(chǎn)生新的變亞型AIV的快速檢測(cè)方法，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR已用
5、于多種病原體的鑒別檢測(cè)制。本研究設(shè)計(jì)了異株；抗原轉(zhuǎn)換是當(dāng)兩種以上不同亞型的AIV共同感染同一細(xì)胞時(shí)，不同毒株的8個(gè)基因片段通過基專門針對(duì)H7N9亞型AIV的引物和探針，建立雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR(Real—timeRT-PCR)進(jìn)行檢因重排，產(chǎn)生新的毒株。變異后的毒株致病性是未知的，有可能突破種間屏障，直接傳染給人類，造成測(cè)，既可確定H7N9亞型AIV感染，也可同時(shí)確定是否為單個(gè)H7、N9亞型AIV感染。的后果無法估量。2009年，甲型HINI流感的暴發(fā)，該H1N1毒株的基因組就是由豬源、人源和禽源1材料與方法等不同來源的片段構(gòu)成[3]。1．1材料
6、自2013年2月以來，上海市、安徽省、江蘇省和1．1．1主要試劑MiniBESTViralRNA／DNA浙江省等地先后發(fā)生不明原因重癥肺炎病例。國家Extraction試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光PCRPremix收稿日期：2013—06—27基金項(xiàng)目：廣西特聘專家專項(xiàng)(2011B020)；廣西科技攻關(guān)重大專項(xiàng)(桂科重1222003—2—4)；廣西科技攻關(guān)(1010014—5)作者簡(jiǎn)介：羅思思(1985一)，女，廣西平南人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事畜禽傳染病分子生物學(xué)研究。*通訊作者2動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展2013年第34卷第12期(總第246期)ExTaq酶為寶生
7、物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；膠回杭州株A／Hangzhou／1／2013(H7Ng)的HA和NA收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；pGEM—TEasy載體序列，分別設(shè)計(jì)了能檢測(cè)H7亞型、N9亞型AIV的為Promaga公司產(chǎn)品。2對(duì)特異性引物和2條TaqMan探針，通過NCBI1．1．2毒株AIV(H2N3、H4N5、H5N1、H7N2、BLAST驗(yàn)證，保證引物擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的靶基因，不與H8N4和H10N3)【6]RNA由香港大學(xué)惠贈(zèng)；AIV其他亞型AIV發(fā)生交叉。引物由Invitrogen公司(H1N7和H11N9)由美國賓夕法尼亞大學(xué)惠贈(zèng)；合成(表1)。
8、H7N9亞型AIV的陽性RNA由廣西壯族自治區(qū)疫1．2．2RNA的抽提和反轉(zhuǎn)錄按
