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《三角褐指藻-脂肪酸脫氫酶基因的克隆及在釀酒酵母中的表達(dá).doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、三角褐指藻D5-脂肪酸脫氫酶基因的克隆及在釀酒酵母中的表達(dá)楊哲,魏東盛,邢來君,李明春南開大學(xué)微生物學(xué)系分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300071摘要:D5-脂肪酸脫氫酶是合成花生四烯酸的關(guān)鍵酶。根據(jù)已報(bào)道的D5-脂肪酸脫氫酶基因設(shè)計(jì)引物,分別從三角褐指藻基因組DNA和總cDNA中擴(kuò)增得到1520bp和1410bp的特異片段,序列分析結(jié)果顯示,結(jié)構(gòu)基因中含有一個(gè)大小為110bp的內(nèi)含子,這是國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。將D5-脂肪酸脫氫酶基因亞克隆到大腸桿菌和釀酒酵母的穿梭表達(dá)載體pYES2.0中,在大腸桿菌中篩選到含有目的片段的重組質(zhì)粒p
2、YPTD5,用電擊轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒pYPTD5轉(zhuǎn)化到營(yíng)養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株INVSc1中,在缺省培養(yǎng)基中篩選得到釀酒酵母轉(zhuǎn)化菌株YPTD5。在合適的培養(yǎng)條件下,添加外源底物雙高g-亞麻酸和誘導(dǎo)物半乳糖,培養(yǎng)并收集菌體。通過脂肪酸甲酯氣相色譜分析,表明三角褐指藻D5-脂肪酸脫氫酶基因在釀酒酵母中獲得了高效的表達(dá),將雙高g-亞麻酸轉(zhuǎn)化為花生四烯酸,其底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到了45.9%。關(guān)鍵詞:花生四烯酸,釀酒酵母,功能驗(yàn)證CloningandexpressioninSaccharomycescerevisiaeofD5-fattyaciddesa
3、turasegenefromPhaeodactylumtricornutumZheYang,DongshengWei,LaijunXing,andMingchunLiKeyLaboratoryofMolecularMicrobiologyandTechnology,MinistryofEducation,DepartmentofMicrobiology,NankaiUniversity,Tianjin300071,ChinaAbstract:Δ5-fattyaciddesaturaseisthekeyenzymeinsynthesisof
4、arachidonicacid.TwospecificfragmentwasclonedfromgenomicDNAandtotalcDNAofPhaeodactylumtricornutumthroughPCRwithprimerdesignedaccordingtothereportedsequences,respectively1520bpand1410bp.ComparisonofthegenomicandcDNAsequencesrevealedthattheΔ5-fattyAcidDesaturasegenefromgenom
5、icDNAhadan110bpintron.The1.4kbwassubclonedintotheyeast-E.colishuttlevectorpYES2.0,thenanexpressionrecombinantplasmidpYPTD5contatiningtargetgenewasconstructed.TheplasmidpYPTD5wastransformedintodefectivemutantINCSc1ofSaccharomycescerevisiaeforexpressionbyelectrotransformati
6、onmethod.Dihomo-g-linolenicacidwasprovidedasanexogenoussubstratetotheyeastcultures,withgalactoseasinducer.ByGCdetecting,therecombinantS.cerecisiaehadarachidonicacid.TheresultsindicatedthathighlevelexpressionofΔ5-fattyaciddesaturase,andthesubstrateconversionreached45.9%.Ke
7、ywords:arachidonicacid,Saccharomycescerevisiae,functionalidentification多不飽和脂肪酸(Polyunsaturatedfattyacids,PUFAs)是指含有2個(gè)或2個(gè)以上雙鍵,碳原子數(shù)在16~22的直鏈脂肪酸[1]。多不飽和脂肪酸的代謝從油酸(Oleicacid,OA)開始,在Δ12-脂肪酸脫氫酶的催化下形成亞油酸(Linoleicacid,LA),亞油酸可以在Δ15-脂肪酸脫氫酶催化下形成a-亞麻酸(α-linolenicacid,ALA),從而進(jìn)入多不飽和脂肪酸
8、代謝的n-3途徑,也可以直接進(jìn)入n-6途徑,經(jīng)過一系列延長(zhǎng)酶和脫氫酶的催化,可以轉(zhuǎn)化成一系列長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(Long-chainpolyunsaturatedfattyacids,LC-P
