蘋果酸-乳酸酶基因克隆 及其在釀酒酵母中的表達(dá)

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1、Oenococcusoeni蘋果酸－乳酸酶基因克隆及其在釀酒酵母中的表達(dá)*中國生物工程雜志ChinaBiotechnology,2005,25(12):50～55劉延琳1蔣思欣2何秀萍2李華1張博潤2**（1西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院楊凌7121002中國科學(xué)院微生物研究所北京100080）摘要蘋果酸－乳酸酶是蘋果酸－乳酸發(fā)酵過程中負(fù)責(zé)蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸的功能酶。在進(jìn)行酒酒球菌SD2a的蘋果酸－乳酸酶基因(mleA)克隆測序基礎(chǔ)上,以PGK1強(qiáng)啟動(dòng)子和ADH1終止子為調(diào)控元件，以大腸桿菌－酵母菌穿

2、梭質(zhì)粒YEp352為載體，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化釀酒酵母YS58。酵母轉(zhuǎn)化子用SD/Ura平板篩選鑒定。斑點(diǎn)雜交檢測表明目的基因mleA轉(zhuǎn)化到受體菌中,SDSPAGE檢測表明獲得的轉(zhuǎn)化子表達(dá)了約60kDa的目標(biāo)蛋白。獲得的轉(zhuǎn)化子在添加了L蘋果酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d；取培養(yǎng)液上清用HPLC檢測L蘋果酸及L乳酸含量，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表明mleA基因進(jìn)行了功能性的表達(dá)，將L蘋果酸轉(zhuǎn)化成L乳酸，L蘋果酸和L乳酸含量分別與對照差異極顯著和顯著，蘋果酸的相對降低率平均為20

3、.95%。在有選擇壓力條件下，重組質(zhì)粒相對穩(wěn)定，而在無選擇壓力條件下，傳代培養(yǎng)10d后大約有65%的重組質(zhì)粒丟失。關(guān)鍵詞酒酒球菌蘋果酸－乳酸酶基因轉(zhuǎn)化表達(dá)收稿日期：20050802修回日期：20050909*陜西省自然科學(xué)基金及西北農(nóng)林科技大學(xué)青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃資助項(xiàng)目**通訊作者，電子信箱：zhangbr@sun.im.ac.cn葡萄酒的釀造包含酒精發(fā)酵和蘋果酸－乳酸發(fā)酵（malolacticfermentation,MLF）兩個(gè)生化過程,分別由酵母菌和乳酸菌在不同條件下完成。由于葡萄

4、酒乳酸菌是在高酒精含量、低pH值及存在有SO2的環(huán)境中生長繁殖，MLF的過程往往比較緩慢，常出現(xiàn)遲滯現(xiàn)象，甚至引發(fā)微生物病害［1~3］。如果能把乳酸菌參與MLF過程的基因通過遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入酵母菌中，使酒精發(fā)酵和MLF由重組酵母單獨(dú)完成，則可減少細(xì)菌引發(fā)的葡萄酒酸敗，避免乳酸菌在MLF過程中產(chǎn)生不必要的代謝副產(chǎn)物，縮短葡萄酒的釀造周期。蘋果酸－乳酸酶（malolacticenzyme,MLE）是MLF過程中降解蘋果酸的功能酶［1,3］。不同來源的蘋果酸－乳酸酶基因在釀酒酵母表達(dá)研究［3~11］取得了一

5、些進(jìn)展。酒酒球菌（Oenococcusoeni）是優(yōu)良的葡萄酒乳酸菌，關(guān)于O.oeni蘋果酸－乳酸酶基因（mleA）的克隆及轉(zhuǎn)換釀酒酵母的研究報(bào)道只有1例［3］，且表達(dá)的效率較低。本研究進(jìn)行我國自行篩選的優(yōu)良酒酒球菌菌系SD2a的mleA基因的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在釀酒酵母中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)，進(jìn)一步探索提高釀酒酵母重組菌株降酸效率的途徑。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株與質(zhì)粒大腸桿菌DH5α、釀酒酵母YS58（MATα,ura3，trp1，leu2，his4）、質(zhì)粒YEp352（amp，URA

6、3，YeastE.coli穿梭載體）、pVC7276、pEA1（YEp352：：TADHI，何秀萍構(gòu)建）、pLmleA（YEp352：：mleA，劉延琳構(gòu)建），均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.2工具酶、抗生素及試劑RNase購自華美生物工程公司；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程有限公司；TaqDNA聚合酶、氨芐青霉素購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心。分析純L蘋果酸購自北京化學(xué)試劑公司，色譜純L蘋果酸和L乳酸均購自Sigma公司。1.1.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件大腸桿菌DH5α保存和培

7、養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，加入氨芐青霉素、IPTG和Xgal的LB培養(yǎng)基用于篩選重組轉(zhuǎn)化子［12］，37℃靜置或振蕩培養(yǎng)；釀酒酵母完全培養(yǎng)基為YEPD培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化子用含有色氨酸、亮氨酸、組氨酸的YNB選擇培養(yǎng)基［13］進(jìn)行篩選鑒定，28℃靜置或振蕩培養(yǎng)。1.1.4引物根據(jù)已發(fā)表的酒球菌mleA基因的核苷酸序列［3］，設(shè)計(jì)相應(yīng)的寡核苷酸引物P1/P2進(jìn)行目的基因的PCR鑒定。下劃線處分別是引入的EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)。P1：5′CGGAATTCATGACAGATCCAGTAAGTAT3′;P2：5

8、′TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT3′；以上引物均委托上海生工公司合成。2005,25(12)劉延琳等：Oenococcusoeni蘋果酸－乳酸酶基因克隆及其在釀酒酵母中的表達(dá)中國生物工程雜志ChinaBiotechnologyVol.25No.1220051.2方法1.2.1基因操作質(zhì)粒抽提、酶切反應(yīng)、DNA片段回收、連接反應(yīng)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等操作均參照“分子克隆”第3版［12］略加修改。1.2.2重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定分別以重組表達(dá)質(zhì)粒及其菌液為模板，用