小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)影響因素探究

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1、小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)影響因素探究　　摘要為了研究新疆小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素，為建立高效和穩(wěn)定的成熟胚愈傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系提出理論依據(jù)。選取有代表性的、在新疆大面積推廣的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和廣試性的新春9號、新春11號和新春26號等3個春小麥品種進行成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)，對不同取材方式、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間等3個因素進行了對比。結(jié)果表明，新春9號、新春26號采用刮碎胚的方式，在25℃環(huán)境下暗培養(yǎng)7d，獲得的愈傷組織適合進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。關(guān)鍵詞小麥；成熟胚；愈傷組織；誘導(dǎo)；影響因素中圖分類號S512.1文獻標(biāo)識碼A文章編號1007-5739

2、（2014）01-0030-01小麥?zhǔn)侨澜缱钪匾募Z食作物之一，但產(chǎn)量頻繁受到非生物和生物脅迫的影響。近年來，新疆的小麥種植面積逐年上升，2014年計劃種植面積113.33萬hm2，其他省市育成的小麥品種很難適應(yīng)新疆特有的干旱和高鹽等脅迫生態(tài)環(huán)境，因此亟需充分利用新疆自育的小麥品種。6采用常規(guī)的育種方式獲得小麥新品種（系）需要較長的育種周期，目前使用較多的是利用轉(zhuǎn)基因方式培育新品種（系）[1]，利用分子改良技術(shù)來培育適應(yīng)新疆環(huán)境的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥[2]。通過轉(zhuǎn)基因的方式進行小麥遺傳轉(zhuǎn)化所選用的受體材料一般是小麥的幼胚，再采用基因槍轟擊或

3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式[3-4]進行遺傳轉(zhuǎn)化，再對愈傷組織進行誘導(dǎo)成苗；但小麥幼胚取材受到時間、空間和季節(jié)的限制，合適的取材時期均難以把握，所取材料的生理狀態(tài)、發(fā)育階段是否一致性也不能很好保障，在一定程度上制約了轉(zhuǎn)基因小麥育種工作的有效開展與應(yīng)用[5]。而小麥的成熟胚取材較方便，且不受季節(jié)、植株發(fā)育階段等因素的限制，能保證不同個體間生理狀態(tài)的一致性，因此建立高效的成熟胚再生體系已成為小麥遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵所在。本研究以新春9號、新春11號和新春26號等3個新疆春小麥品種成熟胚為受體，對不同的取材方式、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)的溫度進行探索，最終確定了適宜

4、的愈傷組織誘導(dǎo)條件，為新疆小麥品種改良和分子育種提供了理論依據(jù)。1材料與方法1.1試驗材料試驗采用新春9號、新春11號和新春26號等3個新疆的春小麥品種。培養(yǎng)基為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，配方為MS大量+MS微量+鐵鹽+Na2EDTA+2，4-D+維生素B5+葡萄糖+水解酪蛋白，pH值5.8。1.2試驗方法1.2.1小麥材料滅菌方法。取小麥成熟種子，依次用70%酒精浸泡表面消毒10min、25%次氯酸鈉256min滅菌，無菌水清洗3～5次，無菌水浸泡過夜。次日，在超凈工作臺內(nèi)轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中，先加入25%次氯酸鈉滅菌15～20min，再用無

5、菌水清洗3～5次，倒盡水分，待用[6]。1.2.2小麥品種的成熟胚取材方式。試驗設(shè)2個取材方式處理，分別為：在一滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)加幾張滅菌濾紙，用鑷子將種子固定，用解剖刀尖將種子胚部分翹下并用刀尖壓碎，然后將成熟胚組織以胚為單位輕輕懸浮接種在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25℃的條件下，暗培養(yǎng)7d（A）；在一滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)加幾張滅菌濾紙，用鑷子將種子固定，用解剖刀刀尖將種子成熟胚組織刮成碎屑[7]，盡量將胚刮得完全并且沒有刮到胚乳，然后將成熟胚組織以胚為單位輕輕懸浮接種在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25℃的條件下，暗培養(yǎng)7d（B）。1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析測定統(tǒng)計

6、愈傷組織誘導(dǎo)率，公式如下：愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)×1002結(jié)果與分析2.1受體材料取材方式不同對愈傷組織誘導(dǎo)的影響6通過對2種不同取材方式（圖1）獲得的材料進行愈傷組織誘導(dǎo)，比較觀察發(fā)現(xiàn)：經(jīng)處理A取材方法處理后的小麥成熟胚愈傷組織半透明淡黃色，較松軟，部分有顆粒狀愈傷形成；經(jīng)處理B方法處理后的小麥成熟胚愈傷組織半透明淡黃色，松軟，愈傷顆粒小，水分含量較多。李衛(wèi)等[6]研究結(jié)果表明，愈傷組織呈半透明致密小顆粒狀易被侵染（圖2），處理A的小麥成熟胚愈傷組織農(nóng)桿菌菌液浸泡時大都呈小塊，不易散開；處理B

7、的小麥成熟胚愈傷組織在農(nóng)桿菌菌液浸泡時會散開呈小顆粒狀易被侵染。因此，應(yīng)采用處理B刮碎胚的方式處理小麥成熟胚。2.2同一培養(yǎng)條件下不同品種的愈傷組織誘導(dǎo)率在相同的培養(yǎng)條件下，將3種小麥成熟胚接種在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10d后觀察發(fā)現(xiàn)：新春9號成熟胚愈傷組織大都呈淡黃色，有部分綠化，通過對4次重復(fù)結(jié)果計算，愈傷誘導(dǎo)率為91.3%；新春11號成熟胚愈傷組織顏色較黃且很少綠化，通過對4次重復(fù)結(jié)果計算，愈傷誘導(dǎo)率為89.5%；新春26號成熟胚愈傷組織部分綠化，通過對4次重復(fù)結(jié)果計算，愈傷誘導(dǎo)率為90.2%（表1）。3結(jié)論6本研究對在新疆大面

8、積推廣的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和廣試性的新春9號、新春11號和新春26號等3個新疆春小麥品種進行成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)，對不同取材方式、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間等3個因素進行對比。結(jié)果顯示：采用刮碎胚的方式獲得的愈傷組織最適合進行農(nóng)桿菌侵染；