DB32∕T 3686-2019 山羊副流感病毒3型檢測(cè)技術(shù)規(guī)程.pdf

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1、ICS65.020.30B40DB32江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T3686—2019山羊副流感病毒3型檢測(cè)技術(shù)規(guī)程TechnicalregulationsfordetectionofCaprineparainfluenzavirus32019-12-03發(fā)布2019-12-25實(shí)施江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布DB32/T3686—2019前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李文良、毛立、李基棕、郝飛、劉茂軍、楊蕾蕾、孫敏。IDB32/T3686—2019山羊副流感病毒3型檢

2、測(cè)技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了山羊副流感病毒3型（Caprineparaifluenzavirus3,CPIV3）的病原學(xué)檢測(cè)（病毒核酸的RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測(cè)）、血清學(xué)檢測(cè)（血凝抑制（HI）試驗(yàn)）的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于山羊副流感病毒3型及其感染情況的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)

3、規(guī)范3病原學(xué)檢測(cè)3.1材料微量移液器及吸頭、DEPC水處理的離心管、吸頭、PCR擴(kuò)增管、TRIzol試劑、三氯甲烷、異丙醇、DEPC處理水（用水符合GB/T6682規(guī)定）、反轉(zhuǎn)錄酶/TaqDNA聚合酶混合液、2×一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖液、一步法熒光定量RT-PCR試劑盒、TAE緩沖液、瓊脂糖、核酸染料、引物MF/MR、引物qMF/qMR與探針（附錄A）。3.2儀器設(shè)備PCR儀、熒光定量PCR儀、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、電泳儀和水平電泳槽、凝膠成相儀（或紫外透射儀）。3.3反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）3.3.1樣品處理與RNA的提取采集羊的鼻拭子、氣管拭子或肺臟（樣品

4、的采集、保存和運(yùn)輸應(yīng)符合NY/T541相關(guān)規(guī)定）。取200μL待檢樣品液至無菌無RNA酶的EP管中，使用TRIzol試劑、RNA提取試劑盒或自動(dòng)化核酸提取儀等方法提取RNA。3.3.2RT-PCR反應(yīng)RT-PCR反應(yīng)使用20μL體系：10μL2×一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖液、引物MF/MR各0.5μL（10μmol/L）、0.4μL反轉(zhuǎn)錄酶/TaqDNA聚合酶混合液、4μLRNA模板，4.6μLDEPC處理水。反應(yīng)條件為：45℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性2min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。3.3.3結(jié)果判定取PCR

5、產(chǎn)物10μL，在1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。樣品PCR檢測(cè)產(chǎn)物電泳后有大小為346bp的片段判斷為山羊副流感病毒3型核酸陽性，無條帶判斷為陰性。每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰陽性對(duì)照，陰陽性對(duì)照應(yīng)不出現(xiàn)或出現(xiàn)相應(yīng)大小的條帶。1DB32/T3686—20193.4熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（熒光定量RT-PCR）3.4.1核酸提取與熒光定量RT-PCR反應(yīng)核酸提取同3.3.1。熒光定量RT-PCR反應(yīng)使用20μL體系：10μL2×一步法反應(yīng)緩沖液，0.4μL反轉(zhuǎn)錄酶，0.4μLDNA聚合酶，引物qMF/qMR各0.4μL（10μmol/L），0.8μL探針

6、，0.4μL染料，2μLRNA模板，5.2μLDEPC處理水。將PCR管置于熒光定量PCR儀器上進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，程序如下：42℃5min；95℃10s；95℃5s，60℃34s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。3.4.2熒光定量RT-PCR結(jié)果判定陽性對(duì)照擴(kuò)增曲線呈標(biāo)準(zhǔn)的S曲線，且Ct值＜30。陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線應(yīng)為基線下的水平線。若樣本曲線呈S形曲線，且Ct值＜38為陽性；未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線為陰性。4血清學(xué)檢測(cè)——血凝抑制（HI）試驗(yàn)4.1材料微量移液器及配套吸頭、96孔V型微量反應(yīng)板、生理鹽水、1%豚鼠紅細(xì)胞懸液（配制方法見附錄B）、病毒液（相關(guān)試驗(yàn)操作應(yīng)符合GB19489的要求）

7、、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。4.2儀器設(shè)備離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱。4.3病毒血凝效價(jià)測(cè)定每次HI試驗(yàn)前應(yīng)對(duì)病毒血凝效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)與判定方法如下：——在反應(yīng)板一排各孔中加25μL生理鹽水；——第一孔中加25μL病毒分離液，按照1:2倍比稀釋，最后一孔不加抗原作陰性對(duì)照。每孔中再加25μLPBS；——每孔加25μL1%豚鼠紅細(xì)胞液，37℃孵育40min；——當(dāng)紅細(xì)胞被凝集時(shí)，紅細(xì)胞均勻分布在反應(yīng)板底部，反應(yīng)板傾斜片刻，紅細(xì)胞不下滑；紅細(xì)胞未被凝集時(shí)，反應(yīng)板傾斜片刻，可見沉淀的紅細(xì)胞向下滑動(dòng)，形成流線。HA效價(jià)為全部紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集