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《熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用課件.ppt》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用基因有限公司技術(shù)支持部張會敏實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR(real-timeQ-PCR)技術(shù):指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過參照標(biāo)準(zhǔn)曲線對反應(yīng)體系中未知模板進(jìn)行量化分析的方法。定量PCR技術(shù)的產(chǎn)生1992年由Higuchi等人第一次報告:使用EB內(nèi)插染料法插至雙鏈DNA,經(jīng)改裝的帶有冷CCD的PCR儀檢測樣品的熒光強度,后來用與雙鏈DNA有更強結(jié)合力的染料SYBRGreenI取代EB90年代早期,發(fā)現(xiàn)TaqDNA多聚酶具有5’核酸外切酶活性,能在DN
2、A雙鏈聚合過程中降解與模板互補的DNA片段(如特異性探針),因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。此后熒光雙標(biāo)記探針的運用使在一密閉的反應(yīng)管中能實時地監(jiān)測反應(yīng)全過程。這些發(fā)現(xiàn)以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運用。PCR循環(huán)雙鏈DNA染料熒光PCR的理論方程:Y=x×(1+Ev)nY:擴增物數(shù)量;X:起始模板數(shù)量;Ev:擴增效率;n:擴增循環(huán)數(shù)1.終點法定量原理:在最佳實驗、循環(huán)次數(shù)n一定、Ev相同的前提下,根據(jù)擴增產(chǎn)物的量可以計數(shù)出反應(yīng)物中原始分子數(shù),若核酸提取效率相同(與標(biāo)準(zhǔn)品),進(jìn)而計算
3、出標(biāo)本中靶分子的準(zhǔn)確含量,即:lnX=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY-b(b為常數(shù))2.實時檢測法定量原理:在最佳實驗、相同Ev以及相同擴增產(chǎn)物的情況下,反應(yīng)物中原始分子數(shù)(X)與其所需要的擴增循環(huán)次數(shù)(n)成反比,若核酸提取效率相同(與標(biāo)準(zhǔn)品),進(jìn)而計算出標(biāo)本中靶分子的準(zhǔn)確含量,即:LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b-n×a(a、b為常數(shù))傳統(tǒng)檢測起始模板的定量方法是終點檢測法,即PCR快到達(dá)平臺期進(jìn)行檢測,而不同起始模板濃度經(jīng)過PCR對數(shù)期擴增到達(dá)平臺期時,最后的差異極小,不僅檢測不準(zhǔn)確,而且檢測重現(xiàn)性很差。同一個模板在96
4、孔PCR儀上做96次重復(fù)實驗,所得結(jié)果有很大差異,因此無法直接從終點產(chǎn)物量準(zhǔn)確推算出起始模板量。實時熒光定量PCR技術(shù)則是根據(jù)不同濃度的起始模板經(jīng)PCR擴增后到達(dá)某一定值時所需要的循環(huán)數(shù)來計算起始模板量,克服終點法檢測過程中“平臺效應(yīng)”對結(jié)果的影響。檢測每一輪循環(huán)的熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可獲得定量的準(zhǔn)確結(jié)果。實時熒光定量PCR中的三個概念增長曲線(primarycurve)熒光閾值(threshold)CT值(CycleThreshold)增長曲線反映熒光強度與循環(huán)數(shù)的對應(yīng)關(guān)系Cyc
5、leFluorescence域值:PCR擴增信號進(jìn)入相對穩(wěn)定對數(shù)增長期時的熒光值。PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的偏差的10倍。熒光域值(Threshold)的設(shè)定確定Ct值Ct值:C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含義是:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性極好,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,得到的Ct值是恒定
6、的.當(dāng)循環(huán)次數(shù)n=Ct時:X=X0×(1+Ex)Ct兩邊取對數(shù),可以推倒出:Ct值與起始模板的關(guān)系logN=logN0+nlogEn=CtCt值與起始模板的關(guān)系研究表明,每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標(biāo)代表Ct值。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。InterpolationofrealtimegraphicaldatatostandardcurveCT值取決于閾值,閾值取
7、決于基線,基線取決于實驗的質(zhì)量,因此CT值是一個完全客觀的參數(shù)。CT值越小,模板DNA的起始拷貝數(shù)越多;CT值越大,模板DNA的起始拷貝數(shù)越少。一般正常的CT值范圍在15-35之間,過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。通過標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品Ct值,就可以計算出樣品中所含的模板量實時在線監(jiān)控對樣品擴增的整個過程進(jìn)行實時監(jiān)控,能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加降低反應(yīng)的非特異性引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合,提高反應(yīng)的特異性增加定量的精確性準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量結(jié)果分析更加快捷方便,無需跑膠熒光定量PCR與普通PCR的比較熒光定量PCR標(biāo)記方法
8、內(nèi)摻式染料SYBRGreenI、LCGreen、EvaGreen序列特異性探針TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特異性探針Ampli