資源描述:
《農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件.ppt》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌,它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位,并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。農(nóng)桿菌感染柳樹產(chǎn)生冠癭瘤原理:根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒,其上有一段T-DNA,農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后,可將T-DNA插入到植物基因組中。因此,農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū),借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合,然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù),再生出轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)
2、桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中,近年來,農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物(尤其是水稻)中也得到了廣泛應(yīng)用。Story冠癭瘤病:雙子葉植物經(jīng)常發(fā)生,因腫瘤著生地面在近地面的根莖交界處,形似帽狀而得名。1907年,Smith&Townsent農(nóng)桿菌誘發(fā)冠癭瘤病。1947年,Braunetal.證實(shí)倆者的關(guān)系,但發(fā)現(xiàn)有的菌株不致病。提出了假說:tumour-inducingprinciple,TIP.腫瘤誘導(dǎo)因子。60’s,腫瘤組織中含高濃度的氨基酸(octopine,nopaline)總稱冠癭堿(opin
3、e)。Petitetal.證實(shí)腫瘤組織合成的冠癭堿取決于菌株,而且菌株能專一地利用冠癭堿作為菌株生存的唯一的碳源和氮源。(證實(shí)了TIP)1974年,Zaenenetal,Schell,VanLarebekeetal.從致瘤農(nóng)桿菌中分離出一類巨大的質(zhì)粒(tumorinducingplasmid),稱為Ti質(zhì)粒。Ti=TIP1977年,Chiltonetal.分子雜交技術(shù)證實(shí)腫瘤細(xì)胞中存在外源的DNA,與Ti質(zhì)粒的DNA有同源性,是整合到了植物染色體的農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA片段,T-DNA(transferred
4、DNA),其內(nèi)有致瘤和冠癭堿合成酶等基因。1981年,Oomsetal.發(fā)現(xiàn)Ti質(zhì)粒上有致瘤區(qū)(virulenceregion),Vir區(qū)。Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞核外存在的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子,長度約200kb,平均周長54.1-75.4um,分子質(zhì)量為(90-150)×106Da。在溫度低與30℃的條件下,Ti質(zhì)??煞€(wěn)定地存在于根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)。Ti質(zhì)粒除上述上述誘導(dǎo)受侵染的植物組織產(chǎn)生冠癭瘤外,還具有以下幾種重要功能:1、賦予根癌農(nóng)桿菌附著于植物細(xì)胞的能力;2、賦予根癌農(nóng)桿菌分解代謝冠癭堿的能力
5、;3、根癌農(nóng)桿菌的寄主植物范圍;4、決定所誘導(dǎo)的冠癭形態(tài)和冠癭堿的成分;5、參與寄主細(xì)胞合成植物激素吲哚乙酸和一些細(xì)胞分裂素的代謝活。1)Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)來自于不同野生型根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)??筛鶕?jù)其產(chǎn)生的冠癭堿類型分為三類:章魚堿(octopine)類胭脂堿(nopaline)類農(nóng)桿堿(agropine)類。Ti質(zhì)粒攜帶著既能分解又能合成這些化合物的酶類和相應(yīng)基因,然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農(nóng)桿菌中表達(dá),它們只有進(jìn)入植物細(xì)胞后才能表達(dá),Ti質(zhì)粒上的冠癭堿分解基因產(chǎn)物卻能分解冠癭堿,為宿主細(xì)胞提供能源、
6、氮源和碳源。長度:160-250kb6大功能區(qū):1)致瘤區(qū),這個(gè)區(qū)主要合成植物生長素和細(xì)胞分裂素;2)冠癭堿合成區(qū);3)冠癭堿分解區(qū);4)Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移區(qū)(tra);5)毒性區(qū)(Vir);6)DNA復(fù)制區(qū)(Rep)。在致瘤區(qū)、冠癭堿合成區(qū)的兩側(cè)存在著一個(gè)24bp直接重復(fù)序列,由這三部分所構(gòu)成的DNA區(qū)域叫做T-DNA。致瘤區(qū)+冠癭堿+左右邊界=T-DNA插入植物染色體中的Ti質(zhì)粒片段只有T-DNA。T-DNA區(qū)域中的這些基因只有在T-DNA插入到植物基因組后才能激活表達(dá).T-DNAT-DNA:Tms1
7、、Tms2、Tmr這3個(gè)基因表達(dá)植物生長素和細(xì)胞分裂素,可調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的生長和發(fā)育,它們的過量表達(dá)刺激植物細(xì)胞大量快速增長而形成冠癭。冠癭堿合成基因在宿主植物體內(nèi)合并分泌出來,被Ti質(zhì)粒上的冠癭堿代謝基因分解成碳源和氮源,供根癌農(nóng)桿菌生長所須。脂堿型根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中T-DNA的左右兩側(cè)是一段24bp的重復(fù)序列,構(gòu)成T-DNA的左邊界和右邊界。在某些章魚堿型根癌農(nóng)根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中T-DNA是以兩個(gè)分開的獨(dú)立片段形式存在,即T-DNA左邊區(qū)段和T-DNA右邊區(qū)段。插入在T-DNA邊界序列之間的任何D
8、NA都可被轉(zhuǎn)到植物染色體中。因此Ti質(zhì)??捎米鐾庠茨康幕虻妮d體。Vir區(qū)(Vir-region):即毒性區(qū)。其長度約為35kb??刂聘┺r(nóng)桿菌附著于植物細(xì)胞和Ti質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)部位,與感染后冠癭形成有關(guān)。Vir區(qū)位于T-DNA區(qū)左側(cè),包含義個(gè)毒性遺傳點(diǎn)(virA、virB、virC、virD、virE和virG)。vir基因控制著T-DNA的轉(zhuǎn)移。virEvirDvirCvirGvirBvirA植物細(xì)胞受傷后,細(xì)胞壁破裂,分泌物中含有高