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1、分子克隆技術(shù)限制性內(nèi)切酶特定的識(shí)別序列，4~6個(gè)堿基對(duì)在識(shí)別序列內(nèi)固定位置切割，5'-端磷酸基因，3'-端羥基基團(tuán)切割后形成粘性或平滑末端…CATCGACGAATTC…GTAGCTGCTTAAGGAATTCTGCCAGGT…EcoRI酶切位點(diǎn)雙鏈切開CTTAAGACGGTCCA……CATCGACGAATTCGCTTAAGACGGTCCA…AATTCTGCCAGGT…GDNA連接酶形成新的DNA雙鏈…GTAGCTGCTTAAAATTCTGCCAGGT..…CATCGACGGACGGTCCA....GTAGCTGCTTAA限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶質(zhì)粒細(xì)
2、胞內(nèi)獨(dú)立于染色體外的環(huán)狀DNA，能自我復(fù)制其上基因可借助宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)得以表達(dá)分子2000~50000bppGEM-TvectormapSub-cloningconstructionofrecombinantpCIA-PinsertionofA-PDNAfragmentintoplasmidpCI構(gòu)建質(zhì)粒的特點(diǎn)Ori區(qū)：復(fù)制起點(diǎn)Par區(qū)：保證質(zhì)粒均勻分布于子細(xì)胞多克隆區(qū)：人為構(gòu)建，便于克隆操作選擇因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑選接合在適當(dāng)?shù)臈l件下，雄性菌和雌性菌混合時(shí)形成配對(duì)的雄性-雌性菌，并有遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移。雄性菌：
3、含F(xiàn)性因子，染色體外環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)化外源DNA能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并通過整合至宿主DNA中或獨(dú)立復(fù)制保存于宿主細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)錄利用噬菌體為媒介，將供體DNA轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)的現(xiàn)象，能在自然狀態(tài)下發(fā)生。分子克隆常用技術(shù)DNA電泳基因轉(zhuǎn)移核酸雜交聚合酶鏈反應(yīng)PCRDNA電泳可分離不同分子量的DNA對(duì)臨床菌株的第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.Ladder1234567891011121314Ladder(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW核酸雜交原理：在一定條件下（溫
4、度、pH值等）DNA雙股螺旋可解開并分離在一定條件下，兩股游離的互補(bǔ)的核苷酸可自行配對(duì)形成雙股SouthernBlot電泳、轉(zhuǎn)移、雜交確定分子量斑點(diǎn)雜交目標(biāo)序列的存在目標(biāo)序列的量聚合酶鏈反應(yīng)PCR細(xì)菌形態(tài)生化反應(yīng)免疫反應(yīng)分子生物學(xué)方法----分子探針雜交----RFLP----PCR唾液在與齲病相關(guān)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用與齲病相關(guān)微生物的定量檢測(cè)方法在人類口腔中檢出率很高茸毛鏈球菌可能比變形鏈球菌與齲損活躍性之間的關(guān)系更密切變形鏈球菌和茸毛鏈球菌唾液在與齲病相關(guān)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用套式PCR快速檢測(cè)人類唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌.譚海平，邊專，樊明文，陳
5、智，范兵.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2003，38：223-226唾液在與齲病相關(guān)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用套式PCR（NestedPCR）5′3′TemplateOuterprimer2Outerprimer1ThefirstPCR5′3′Interprimer2Interprimer1NexttemplateThesecondPCR5′3′ThesecondPCRproduct本套式PCR的引物是分別根據(jù)變形鏈球菌gtfB基因和茸毛鏈球菌gtfI基因設(shè)計(jì)的內(nèi)、外兩套引物（outerprimer,interprimer）gtfBgeneofS.mutansOute
6、rprimerthp4Outerprimerthp3ThefirstPCRInterprimerthp8Interprimerthp7Outerprimerthp6gtfIgeneofS.sobrinusOuterprimerthp5ThefirstPCRInterprimerthp10Interprimerthp9ThesecondPCRThesecondPCR抽提細(xì)菌染色體DNA（Igarashietal.1996）----細(xì)菌----唾液PCR反應(yīng)過程第一次PCR反應(yīng)預(yù)變性:94℃4min變性:94℃1min退火:51℃1min30cycles
7、延伸:72℃2min最后延伸:72℃5min第二次PCR反應(yīng)abcdefghLadder12345678選擇外引物行第一次PCR后擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析以變鏈菌組(MutansStreptococci)染色體DNA為模板Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7;6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.MW(Kb)2.01.00.250.10.750.5abcdef
8、ghLadder12345678選擇內(nèi)引物行第二次PCR后擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析Lane1:S.cricetu
