分子克隆技術(shù)步驟

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1、分子克隆技術(shù)步驟在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過(guò)轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增，然后再?gòu)暮Y選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴(kuò)增?？寺≡谏飳W(xué)中其名詞含義系指一個(gè)細(xì)胞或個(gè)體以無(wú)性繁殖的方式產(chǎn)生一群細(xì)胞或一群個(gè)體，在不發(fā)生突變的情況下，具有完全相同的遺傳性狀，常稱無(wú)性繁殖(細(xì)胞)系；其動(dòng)詞(clone,cloned,cloning)含義指在生物體外用重組技術(shù)將特定基因插入載體分子中

2、，即分子克隆技術(shù)。將DNA片段(或基因)與載體DNA分子共價(jià)連接，然后引入寄主細(xì)胞，再篩選獲得重組的克隆，按克隆的目的可分為DNA和cDNA克隆兩類。cDNA克隆是以mRNA為原材料，經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA(cDNA)，再與載體DNA分子連接引入寄主細(xì)胞。每一cDNA反映一種mRNA的結(jié)構(gòu)，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。特點(diǎn)是：①有些生物，如RNA病毒沒(méi)有DNA，只能用cDNA克?。虎赾DNA克隆易篩選，因?yàn)閏DNA庫(kù)中不包含非結(jié)構(gòu)基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一個(gè)mRNA的信息；③cDNA能在細(xì)菌中表達(dá)。cDNA僅

3、代表某一發(fā)育階段表達(dá)出來(lái)的遺傳信息，只有基因文庫(kù)才包含一個(gè)生物的完整遺傳信息。1.方法：(1)DNA片段的制備：常用以下方法獲得DNA片段：①用限制性核酸內(nèi)切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機(jī)片段；③在已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對(duì)應(yīng)的基因片段；④從mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。(2)載體DNA的選擇：①質(zhì)粒：質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外遺傳因子，DNA呈環(huán)狀，大小為1-200千堿基對(duì)(kb)。在細(xì)胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質(zhì)粒DNA可通過(guò)轉(zhuǎn)化引入寄主菌。在細(xì)胞中有兩種狀態(tài)，一是

4、“緊密型”；二是“松馳型”。此外還應(yīng)具有分子量小，易轉(zhuǎn)化，有一至多個(gè)選擇標(biāo)記的特點(diǎn)。質(zhì)粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用于構(gòu)建原核生物基因文庫(kù)，cDNA庫(kù)和次級(jí)克隆。②噬菌體DNA：常用的λ噬菌體的DNA是雙鏈，長(zhǎng)約49kb，約含50個(gè)基因，其中50%的基因?qū)κ删w的生長(zhǎng)和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體DNA兩端。中間是非必需區(qū)，進(jìn)行改造后組建一系列具有不同特點(diǎn)的載體分子。λ載體系統(tǒng)最適用于構(gòu)建真核生物基因文庫(kù)和cDNA庫(kù)。M13噬菌體是一種獨(dú)特的載體系統(tǒng)，它只能侵襲具有F基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF

5、)在寄主菌內(nèi)是雙鏈環(huán)狀分子，象質(zhì)粒一樣自主制復(fù)，制備方法同質(zhì)粒。寄主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地制備單鏈DNA，用于DNA順序分析、定點(diǎn)突變和核酸雜交。③拷斯(Cos)質(zhì)粒：是一類帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質(zhì)粒DNA分子。是噬菌體－質(zhì)?；旌衔铩４祟愝d體分子容量大，可攜帶45kb的外源DNA片段。也能象一般質(zhì)粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉(zhuǎn)化寄主菌。這類載體常被用來(lái)構(gòu)建高等生物基因文庫(kù)。(3)DNA片段與載體連接：DNA分子與載體分子連接是克隆過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一，方法有：①粘性末端連接，DNA片段兩端的互補(bǔ)堿基順序稱之為

6、粘性末端，用同一種限制性內(nèi)切酶消化DNA可產(chǎn)生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復(fù)原樣，有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別不同順序，卻能產(chǎn)生相同末端。②平頭末端連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產(chǎn)生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來(lái)，但連接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端連接。④人工接頭分子連接，在平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶作用后就會(huì)產(chǎn)生粘性末端。連接反應(yīng)需注意載體DNA與DNA片段的比率。以λ或Cos質(zhì)粒為載體時(shí)，形成線性多連體

7、DNA分子，載體與DNA片段的比率高些為佳。以質(zhì)粒為載體時(shí)，形成環(huán)狀分子，比率常為1∶1。(4)引入寄主細(xì)胞：常用兩種方法：①轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，方法是將重組質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA(M13)與氯化鈣處理過(guò)的宿主細(xì)胞混合置于冰上，待DNA被吸收后鋪在平板培養(yǎng)基上，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用選擇性培養(yǎng)基篩選重組子，通常重組分子的轉(zhuǎn)化效率比非重組DNA低，原因是連接效率不高，有許多DNA分子無(wú)轉(zhuǎn)化能力，而且重組后的DNA分子比原載體DNA分子大，轉(zhuǎn)化困難。②轉(zhuǎn)導(dǎo)，病毒類侵染宿主菌的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)，一般轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率比轉(zhuǎn)化高。(5)克隆的選擇：①直接篩選：有些載體帶有

8、可辨認(rèn)的遺傳標(biāo)記，能有效地將重組分子與本底區(qū)分。例如：有些λ噬菌體攜帶外源基因后形成的噬菌斑就會(huì)從原來(lái)的混濁變?yōu)榍辶?；還有些載體分子攜帶外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯