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1、植保生物技術(shù)講座05第五講分子克隆技術(shù)克隆載體是用來在生物學(xué)寄主和試管間“傳送”克隆的序列的DNA分子(如從細(xì)菌到試管再到植物細(xì)胞)。其共性有四點：1.啟動自發(fā)復(fù)制的能力. 2.含有遺傳標(biāo)記(通常是顯性的)供選擇。3.唯一的限切位點以利于克隆插入的DNA4.非必需DNA序列盡可能少以克隆更大片段。pBR322pBR322pBR322是4362bp的環(huán)狀雙鏈DNA載體，有2個抗藥性基因（四環(huán)素和氨芐青霉素），一個復(fù)制起始點和多個用于克隆的限制酶切點。當(dāng)缺失抗藥性基因的大腸桿菌被pBR322成功地轉(zhuǎn)化時，它便從該質(zhì)粒獲得了抗生素抗性。兩個抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的單一酶切
2、位點。一般只選一個抗生素基因作為插入外源DNA之用。外源DNA插入后該抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因則作為轉(zhuǎn)化細(xì)菌后篩選陽性克隆之用。四個重要位點(1)負(fù)責(zé)質(zhì)粒復(fù)制的rep復(fù)制子(來自pMB1;(2)編碼Rop蛋白的rop基因，促進(jìn)不穩(wěn)定的RNA?I–RNA?II復(fù)合體轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的復(fù)合體并起著減少質(zhì)?？截悢?shù)的作用(來自pMB1);(3)編碼beta-內(nèi)酰胺酶的bla基因，賦予對氨芐青霉素的抗性(來自Tn3轉(zhuǎn)座子);(4)編碼四環(huán)素抗性蛋白的tet基因(來自pSC101).pUC系列質(zhì)粒是2.7Kb的雙鏈DNA質(zhì)粒，有一個復(fù)制起點，一個氨芐青霉素抗性基因和一個多克隆位點，多克隆位點處
3、于表達(dá)LacZ基因產(chǎn)物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LacZ基因有突變的大腸桿菌株（M15）時，因為由質(zhì)粒表達(dá)的α－肽補充了大腸桿菌卻失的α－肽，所以恢復(fù)了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，長出藍(lán)色克隆。如果在多克隆位點內(nèi)插入外源DNA，由于它破壞了α－肽的表達(dá)，因而在加入IPTG和X－gal的培養(yǎng)基，不能長出藍(lán)色克隆，這就是所謂的藍(lán)白篩選。pUC19pUC18和pUC19小、高拷貝數(shù),長2686bp只有多克隆位點(MCS)排列方向不同pUC18/19含有:(1)pMB1復(fù)制子rep(來自pBR322)，因缺失了rop基因和在pMB1的rep復(fù)制子
4、單個位點突變而導(dǎo)致了高拷貝數(shù);(2)編碼beta-內(nèi)酰胺酶的bla基因，賦予對氨芐青霉素的抗性(來自pBR322)，這個基因上有兩個點突變，因而不同于pBR322的bla基因;(3)lac操作元的區(qū)域含有CAP（代謝物活化蛋白）結(jié)合位點,啟動子Plac,lac阻遏蛋白結(jié)合位點編碼beta-半乳糖苷酶N-端的多肽的lacZ基因的5‘端(來自M13mp18/19).。這個多肽片段的合成可受IPTG誘導(dǎo)，與突變菌(mutationlacZDM15)實現(xiàn)alfa互補。pUC18和pUC19pUC19圖pBluescriptII系列均為2961bp長，用于DNA克隆、雙脫氧DNA測序、體外誘變和
5、在簡單體系中體外轉(zhuǎn)錄。pBluescriptIISK和KS這兩個載體只有l(wèi)acZ基因中的多克隆位點的方向不同。pBluescriptII載體上的重要位點(1)f1(IG)–噬菌體f1的基因間區(qū);(2)rep(pMB1)–pMB1的復(fù)制子，負(fù)責(zé)質(zhì)粒的復(fù)制；(3)bla(ApR)–編碼beta-內(nèi)酰胺酶的bla基因，賦予對氨芐青霉素的抗性;(4)lacZ基因的5’-端序列，編碼編碼beta-半乳糖苷酶的N-端多肽，有了這個這個多肽片段，就可以菌落藍(lán)白反應(yīng)對重組質(zhì)粒進(jìn)行篩選pBluescriptIIKS/SKpBluescriptSKM13mp18和M13mp19載體單鏈、雄性?；腄NA絲
6、狀M13的衍生物。兩個載體均為7250bp長，其多克隆位點方向相反。在E.coli操作元lac區(qū)含CAP蛋白結(jié)合位點、啟動子Plac、lac阻遏蛋白結(jié)合位點和lacZ基因的5’-端序列(lacZ基因的第6-7個密碼子被多克隆位點取代)。M13mp18/19結(jié)構(gòu)圖多克隆位點Lambda噬菌體Lambda噬菌體是一種大腸桿菌的溫和性噬菌體。其DNA是線狀的、雙鏈的(48502nt)，兩端的5’-端有12個堿基是單鏈的，堿基互補的。噬菌體DNA注射到菌體內(nèi)后末端堿基互補而環(huán)化。在裂菌循環(huán)途徑，噬菌體編碼復(fù)制、溶菌和衣殼蛋白的基因表達(dá)。噬菌體DNA復(fù)制，復(fù)制品被切下來，包裝到子代噬菌體粒體中。
7、在溶原循環(huán)中，噬菌體基因的表達(dá)受到遏制，其DNA通過重組插入到細(xì)菌染色體中。Lambda噬菌體唯一切點Lambda噬菌體載體cos質(zhì)粒是lambda噬菌體和質(zhì)粒的雜種，其優(yōu)點是可以用來插入較大的DNA片段，再轉(zhuǎn)入細(xì)菌。cos質(zhì)粒載體一個典型的質(zhì)?？寺〖夹g(shù)涉及5步1)用限制性內(nèi)切酶消化DNA樣品2)用限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒DNA3)連接樣品DNA和質(zhì)粒DNA的消化產(chǎn)物4)用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞5)涂布在瓊脂平板上進(jìn)行耐抗菌素篩選克隆示意圖
