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《GBT18641-2002偽狂犬病診斷技術(shù).doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、GB/T18641-2002偽狂犬病診斷技術(shù)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了偽狂犬病的診斷方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬、羊、犬、貓等及其他易感動(dòng)物偽狂犬病的診斷。其中病毒分離鑒定、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、家兔接種試驗(yàn)適用于偽狂犬病病毒的檢測(cè)；中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)適用于非免疫動(dòng)物偽狂犬病抗體的檢測(cè)以及免疫后抗體水平的監(jiān)測(cè)；膠乳凝集試驗(yàn)適用于實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)對(duì)偽狂犬病抗體的早期檢測(cè)。2病毒分離鑒定2.1試驗(yàn)材料改良最低要素營養(yǎng)液(DMEM)培養(yǎng)基配方見附錄A(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)，倉鼠腎細(xì)胞(BHK21)或豬腎細(xì)胞系(PK-15)細(xì)胞，新
2、生犢牛血清，青霉素，鏈霉素，0.22μm微孔濾膜，細(xì)胞培養(yǎng)瓶。2.2操作步驟2.2.1病料的采集：對(duì)死亡病畜或活體送檢并處死的動(dòng)物，以無菌手術(shù)采集大腦、三叉神經(jīng)節(jié)、扁桃體、肺等組織，冷藏送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。2.2.2樣品處理：待檢組織在滅菌乳缽內(nèi)剪碎，加入滅菌玻璃砂研磨，用滅菌生理鹽水或DMEM培養(yǎng)液(見附錄A)制成I：5乳劑，反復(fù)凍融三次，經(jīng)3000r/min離心30min后，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，加入青霉素溶液至最終濃度為300IU/ml，鏈霉素為100μg/ml，-70℃保存作為接種材
3、料。2.2.3病料接種：將病料濾液接種已長成單層的BHK21細(xì)胞(或PK-15細(xì)胞)，接種量為培養(yǎng)液量的10%，37℃恒溫箱中吸附1h，加入含10%新生犢牛血清(已經(jīng)過56℃，水浴滅活30min，過濾除菌，無支原體)的DMEM培養(yǎng)液，置37℃溫箱中培養(yǎng)。2.2.4觀察結(jié)果：接種后36-72h，細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE}，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，拉網(wǎng)、脫落。如第-次接種不出現(xiàn)細(xì)胞病變，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳三代，如仍無細(xì)胞病變，則判為偽狂犬病病毒檢測(cè)陰性。2.2.5病毒的鑒定：將出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)
4、胞培養(yǎng)物，用聚合酶鏈反應(yīng)或家兔接種試驗(yàn)，或作進(jìn)-步鑒定。3聚合酶鏈反應(yīng)3.1試驗(yàn)材料蛋白酶K，十二烷基硫酸鈉（SDS)，苯酚，三氯甲烷，異戊醇(分析純)，溴化乙錠(EB，TEN緩沖液〔見附錄B(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)〕。引物：擴(kuò)增偽狂犬病毒基因中理；4341-對(duì)(bP)之間217bP基因片段，序列為：上游引物P1：5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’，下游引物P2：5’-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3’.3.2操作步驟3.2.1樣品的采集：對(duì)于病死或撲殺動(dòng)物，取大腦和三叉神經(jīng)節(jié)
5、、扁桃體、肺等組織；對(duì)于待檢活狂已滅菌的棉簽，伸入豬鼻腔中，采取鼻粘液，即為鼻拭子，冷藏條件下送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。3.2.2樣品處理每份樣品分別處理。采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按1：5用TEN緩沖液(見錄B中B1)懸浮收集于離心管內(nèi)，反復(fù)凍融3次，700Or/min離心5min，如樣品為鼻拭子，.則加入2mlTEN緩沖液，充分?jǐn)D壓，取出棉拭子，7O00r/min離心5min，取上清液472.5μl，加入25μl10%十二烷基硫酸鈉(見附錄B中B4)和2.5μl的20mg/ml，蛋自酶K(見附錄B中B3)
6、水浴搖床上放置2h后加入等量的飽和酚溶液500μl，渦旋20s。離心取上清液，加等量的酚：三氯甲烷：異戍醇（25：24：1）抽提-次，再用等量的三氯甲烷：異戍醇(24：1)抽提-次，最后用兩倍的無水乙醇沉淀，真空抽干后加入205μl雙蒸水溶解(此即為“模板”)，-20℃貯存?zhèn)溆谩?.2.3聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的操作程序：先將制備的模板DNA置100℃水浴10min作變性處理，然后立即放于冰浴中PCR反應(yīng)體系(按摩爾濃度計(jì)算)為：總體積25μl，含有50mmol/l(氯化鉀)(KCI)，10mmol
7、/l，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Chris-Hcl(PH9.0)，0.1%三甲基氨基甲烷溶液(0.1%TritonX-100)，100μmol/LdNTPs，0.35μmol/l引物，2mol/l氯化鎂(Mgcl2)，及0.5U臺(tái)克(TAq)DNA聚合酶，2μl模板DNA最后加入礦物油約20μl覆蓋。擴(kuò)增條件為：94℃變性3min，進(jìn)入循環(huán)，94℃60s，65℃60s，72℃60s，40個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min。3.2.4PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：將樣品分別加于l%瓊脂凝膠板的各樣品孔中，有-孔加標(biāo)準(zhǔn)陽性樣
8、品，每孔10μl-15μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行電泳，溴化乙錠(見附錄B中B2)染色，在紫外光下觀察結(jié)果。電泳區(qū)帶遷移率與標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品區(qū)帶遷移率相同的待檢樣品應(yīng)判為陽性。為進(jìn)-步進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性鑒定，可取PCR產(chǎn)物用SAll酶切，酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，在紫外光下觀察并與標(biāo)準(zhǔn)分子量相對(duì)照，陽性樣品可出現(xiàn)140bP和77bP兩個(gè)片段。4家兔接種試驗(yàn)4.1家兔的選擇選擇健康成年家兔，用血清中和試驗(yàn)、膠乳凝集試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
