《GBT186 41-2002-偽狂犬病診斷技術(shù)》.pdf

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1、GB1T18641-2002前言偽狂犬病(pseudorabies,YR;Aujeszky'sdisease,AD)是危害豬、牛、羊、狗、貓、家兔等多種家畜和野生動物的一種急性傳染病。除豬以外的動物感染偽狂犬病病毒后，主要是以發(fā)熱、奇癢和腦脊髓炎癥狀為特征.以死亡為結(jié)局，并呈散發(fā)形式。本病對養(yǎng)豬業(yè)危害最大，豬感染后可引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎;仔豬大量死亡，15日齡內(nèi)死亡率為100%,斷奶仔豬死亡率10%-20%，種豬不育，母豬返情，空懷，公豬翠丸發(fā)炎腫脹、萎縮、失去種用能力;育肥豬增重緩慢、

2、飼料報酬降低。本病呈世界性分布。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的病原學(xué)診斷方法主要用于死亡動物的病料檢測和活體動物的鼻拭子樣品檢測，其中聚合酶鏈反應(yīng)具有快速、靈敏的特點(diǎn)，可用于大批樣品的檢測。血清學(xué)診斷主要用于非免疫動物的診斷、血清流行病學(xué)調(diào)查和免疫動物的抗體水平監(jiān)測。中和試驗特異性強(qiáng)，是國際通用的法定方法，可用于日岸進(jìn)出口檢疫;膠乳凝集試驗，簡便快速、敏感性高、特異性強(qiáng)，適用于基層現(xiàn)場檢測;酶聯(lián)免疫吸附試驗適用于實驗室大批樣品檢查、產(chǎn)地檢疫、流行病學(xué)調(diào)查和無本病健康豬群的建立。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D都是

3、標(biāo)準(zhǔn)的附錄，附錄E是提示的附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院負(fù)責(zé)起草，農(nóng)業(yè)部動物檢疫所參加起草本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:陳煥春、何啟蓋、李曉成、吳斌、方六榮、金梅林、邱德新、吳美州。中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18641--2002偽狂犬病診斷技術(shù)DiagnostictechniquesforAujeszk'sdisease1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了偽狂犬病的診斷方法本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬、羊、犬、貓等及其他易感動物偽狂犬病的診斷。其中病毒分離

4、鑒定、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、家兔接種試驗適用于偽狂犬病病毒的檢測;中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗適用于非免疫動物偽狂犬病抗體的檢測以及免疫后抗體水平的監(jiān)測;膠乳凝集試驗適用于實驗室和現(xiàn)場對偽狂犬病抗體的早期檢測。2病毒分離鑒定2門試驗材料改良最低要素營養(yǎng)液(DMEM)培養(yǎng)基配方見附錄A(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)，倉鼠腎細(xì)胞(BHK2,)或豬腎細(xì)胞系(PK-15)細(xì)胞，新生犢牛血清，青霉素，鏈霉素，。.22pm微孔濾膜，細(xì)胞培養(yǎng)瓶。2.2操作步驟2.2門病料的采集對死亡病畜或活體送檢并處死的動物，以無菌手術(shù)采集大腦、三叉神經(jīng)

5、節(jié)、扁桃體、肺等組織，冷藏送實驗室檢測2.2.2樣品處理:待檢組織在滅菌乳缽內(nèi)剪碎，加入滅菌玻璃砂研磨，用滅菌生理鹽水或DMEM培養(yǎng)液(見附錄A〕制成I，5乳劑，反復(fù)凍融三次，經(jīng)3000r/min離心30min后，取上清液經(jīng)0.22pm微孔濾膜過濾，加人青霉素溶液至最終濃度為300lU/m工一、鏈霉素為100pg/ml，一70℃保存作為接種材料2.2.3病料接種:將病料濾液接種已長成單層的BHK細(xì)胞(或PK-15細(xì)胞)，接種量為培養(yǎng)液量的10Y,37C恒溫箱中吸附1h，加人含10%新生犢牛血清(已經(jīng)過

6、56(’水浴滅活30min，過濾除菌，無支原體)的DMEM培養(yǎng)液，置37C溫箱中培養(yǎng)。2.2.4觀察結(jié)果:接種后364-72h，細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，拉網(wǎng)、脫落。如第一次接種不出現(xiàn)細(xì)胞病變，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳三代，如仍無細(xì)胞病變，則判為偽狂犬病病毒檢測陰性2.2.5病毒的鑒定:將出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)物，用聚合酶鏈反應(yīng)或家兔接種試驗，或作進(jìn)一步鑒定。3聚合酶鏈反應(yīng)3.1試驗材料蛋白酶K,f一二烷基硫酸鈉(SDS)，苯酚，三氯甲烷，異戊醇(分析純)，澳化乙錠(EB

7、),TEN緩沖液〔見附錄B(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)〕。引物:擴(kuò)增偽狂犬病毒基因中434-651堿基對(bp)之問217by基因片段，序列為V-游引物III中華人民共和國國家質(zhì)f監(jiān)督檢驗檢疫總局2002-02-19批準(zhǔn)2002-05-01實施GB/T18641-20025'-('AGGAGGACGA(;CTGGGGCT-3'，下游引物P2:5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3'o3.2操作步驟32.飛樣品的采集:對于病死或撲殺動物，取大腦和三叉神經(jīng)節(jié)、扁桃體、肺等組織;對于待檢活豬，用已滅菌的棉簽

8、，伸人豬鼻腔中，采取鼻粘液，即為鼻拭子，冷藏條件下送實驗室檢測。3.2.2樣品處理每份樣品分別處理。采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按I:5用TEN緩沖液(見附錄B中131)懸浮收集于離心管內(nèi)，反復(fù)凍融3次，7000r/min離心5min，如樣品為鼻拭子，則加入2nil,TEN緩沖液充分?jǐn)D壓，取出棉拭子，7000r/min離心5min，取上清液472.5川，加人25可Io%1一二烷基硫酸鈉(見附錄“中B4)和2.5pI的20mg/mI蛋自酶K(見附錄B中B3