GBT 18641-2002 偽狂犬病診斷技術(shù)

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1、GB1T18641-2002前言偽狂犬病(pseudorabies,YR;Aujeszky'sdisease,AD)是危害豬、牛、羊、狗、貓、家兔等多種家畜和野生動(dòng)物的一種急性傳染病。除豬以外的動(dòng)物感染偽狂犬病病毒后，主要是以發(fā)熱、奇癢和腦脊髓炎癥狀為特征.以死亡為結(jié)局，并呈散發(fā)形式。本病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害最大，豬感染后可引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎;仔豬大量死亡，15日齡內(nèi)死亡率為100%,斷奶仔豬死亡率10%-20%，種豬不育，母豬返情，空懷，公豬翠丸發(fā)炎腫脹、萎縮、失去種用能力;育肥豬增重緩慢、飼

2、料報(bào)酬降低。本病呈世界性分布。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的病原學(xué)診斷方法主要用于死亡動(dòng)物的病料檢測(cè)和活體動(dòng)物的鼻拭子樣品檢測(cè)，其中聚合酶鏈反應(yīng)具有快速、靈敏的特點(diǎn)，可用于大批樣品的檢測(cè)。血清學(xué)診斷主要用于非免疫動(dòng)物的診斷、血清流行病學(xué)調(diào)查和免疫動(dòng)物的抗體水平監(jiān)測(cè)。中和試驗(yàn)特異性強(qiáng)，是國(guó)際通用的法定方法，可用于日岸進(jìn)出口檢疫;膠乳凝集試驗(yàn)，簡(jiǎn)便快速、敏感性高、特異性強(qiáng)，適用于基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)適用于實(shí)驗(yàn)室大批樣品檢查、產(chǎn)地檢疫、流行病學(xué)調(diào)查和無(wú)本病健康豬群的建立。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D都是標(biāo)準(zhǔn)

3、的附錄，附錄E是提示的附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院負(fù)責(zé)起草，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所參加起草本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:陳煥春、何啟蓋、李曉成、吳斌、方六榮、金梅林、邱德新、吳美州。中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18641--2002偽狂犬病診斷技術(shù)DiagnostictechniquesforAujeszk'sdisease1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了偽狂犬病的診斷方法本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬、羊、犬、貓等及其他易感動(dòng)物偽狂犬病的診斷。其中病毒分離鑒定、

4、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、家兔接種試驗(yàn)適用于偽狂犬病病毒的檢測(cè);中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)適用于非免疫動(dòng)物偽狂犬病抗體的檢測(cè)以及免疫后抗體水平的監(jiān)測(cè);膠乳凝集試驗(yàn)適用于實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)對(duì)偽狂犬病抗體的早期檢測(cè)。2病毒分離鑒定2門試驗(yàn)材料改良最低要素營(yíng)養(yǎng)液((DMEM)培養(yǎng)基配方見(jiàn)附錄A(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)，倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK2,)或豬腎細(xì)胞系((PK-15)細(xì)胞，新生犢牛血清，青霉素，鏈霉素，。.22pm微孔濾膜，細(xì)胞培養(yǎng)瓶。2.2操作步驟2.2門病料的采集對(duì)死亡病畜或活體送檢并處死的動(dòng)物，以無(wú)菌手術(shù)采集大腦、三叉神經(jīng)節(jié)、

5、扁桃體、肺等組織，冷藏送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)2.2.2樣品處理:待檢組織在滅菌乳缽內(nèi)剪碎，加入滅菌玻璃砂研磨，用滅菌生理鹽水或DMEM培養(yǎng)液(見(jiàn)附錄A〕制成I，5乳劑，反復(fù)凍融三次，經(jīng)3000r/min離心30min后，取上清液經(jīng)0.22pm微孔濾膜過(guò)濾，加人青霉素溶液至最終濃度為300lU/m工一、鏈霉素為100pg/ml，一70℃保存作為接種材料2.2.3病料接種:將病料濾液接種已長(zhǎng)成單層的BHK細(xì)胞(或PK-15細(xì)胞)，接種量為培養(yǎng)液量的10Y,37C恒溫箱中吸附1h，加人含10%新生犢牛血清(已經(jīng)過(guò)56(

6、’水浴滅活30min，過(guò)濾除菌，無(wú)支原體)的DMEM培養(yǎng)液，置37C溫箱中培養(yǎng)。2.2.4觀察結(jié)果:接種后364-72h，細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)((CPE)，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，拉網(wǎng)、脫落。如第一次接種不出現(xiàn)細(xì)胞病變，應(yīng)將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后盲傳三代，如仍無(wú)細(xì)胞病變，則判為偽狂犬病病毒檢測(cè)陰性2.2.5病毒的鑒定:將出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞培養(yǎng)物，用聚合酶鏈反應(yīng)或家兔接種試驗(yàn)，或作進(jìn)一步鑒定。3聚合酶鏈反應(yīng)3.1試驗(yàn)材料蛋白酶K,f一二烷基硫酸鈉(SDS)，苯酚，三氯甲烷，異戊醇(分析純)，澳化乙錠(EB),T

7、EN緩沖液〔見(jiàn)附錄B(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)〕。引物:擴(kuò)增偽狂犬病毒基因中434-651堿基對(duì)((bp)之問(wèn)217by基因片段，序列為V-游引物III中華人民共和國(guó)國(guó)2002-05-01實(shí)施GB/T18641-20025'-('AGGAGGACGA(;CTGGGGCT-3'，下游引物P2:5'-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3'o3.2操作步驟32.飛樣品的采集:對(duì)于病死或撲殺動(dòng)物，取大腦和三叉神經(jīng)節(jié)、扁桃體、肺等組織;對(duì)于待檢活豬，用已滅菌的棉簽，伸人豬鼻腔中，采取鼻粘液，即為鼻拭子，冷藏條件下送

8、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。3.2.2樣品處理每份樣品分別處理。采病料經(jīng)組織研磨器充分研磨，按I:5用TEN緩沖液(見(jiàn)附錄B中131)懸浮收集于離心管內(nèi)，反復(fù)凍融3次，7000r/min離心5min，如樣品為鼻拭子，則加入2nil,TEN緩沖液充分?jǐn)D壓，取出棉拭子，7000r/min離心5min，取上清液472.5川，加人25可Io%1一二烷基硫酸鈉(見(jiàn)附錄“中B4)和2.5pI的20mg/mI蛋自酶K(見(jiàn)附錄B中B3),50C水浴搖床上放置2h后加人等量