腫瘤多藥耐藥的基因治療.doc

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1、腫瘤多藥耐藥的基因治療劉忠民　王克勇　陳勇　　腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受性是腫瘤治療的主要障礙。臨床上許多腫瘤在經(jīng)歷了最初有效的化療之后，最終仍難免于復(fù)發(fā)，其主要原因是腫瘤細(xì)胞對化療產(chǎn)生耐受性。因此，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，是提高腫瘤化療療效的關(guān)鍵。研究表明，腫瘤細(xì)胞mdrl基因編碼的p-糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)的過度表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(multidrugresistance,MDR)的重要原因［1］。目前許多藥物可以用來逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的MDR，但不能從根本上解決問題，效果欠佳，而且具有一定的毒副作用［2］。與傳統(tǒng)的藥物治療相比，基因治療具

2、有作用特異，敏感，毒副作用低等諸多優(yōu)點，在MDR逆轉(zhuǎn)中有廣闊的發(fā)展前景。1　MDRl基因的反義寡聚脫氧核糖核酸(AOD)　　李惠芳等利用互補于MDRl基因5′末端轉(zhuǎn)錄起始部位的AOD轉(zhuǎn)染表達(dá)MDRl基因的KB-8-5細(xì)胞株后，細(xì)胞內(nèi)P-gp表達(dá)水平下降，細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素濃度提高，被轉(zhuǎn)染細(xì)胞對藥物的LC50由原來藥物敏感株的5.6倍降為3.2倍。以上結(jié)果說明AOD逆轉(zhuǎn)了P-gp介導(dǎo)的藥物耐受性，但逆轉(zhuǎn)作用不完全。作者分析其原因之一為AOD的降解問題。為此，作者以脂質(zhì)體Lipofectin作為轉(zhuǎn)基因載體，使AOD的耐藥逆轉(zhuǎn)作用有所提高，提示脂質(zhì)體可作為引導(dǎo)AOD靶向治療的

3、方式之一［3］?！　♂槍OD的降解問題，Cucco等利用硫代磷酸修飾的MDRl基因的AOD進(jìn)行MDR逆轉(zhuǎn)，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)外均明顯提高白血病細(xì)胞耐藥細(xì)胞系對長春新堿(VCR)的敏感性［4］。因修飾后可增加AOD對核酸酶清除作用的耐受性，且易溶于水，能更有效地與靶基因進(jìn)行雜交，從而增加了其逆轉(zhuǎn)作用［5］。另有作者則認(rèn)為對核酸上的氧原子進(jìn)行硫代化、甲基化或用脂質(zhì)體進(jìn)行包裹等方法在提高細(xì)胞攝入AOD的同時，一方面增加了細(xì)胞毒性，同時也降低了核酸反義抑制的效應(yīng)。將低分子量的聚乙二醇(PEG)連接在AOD的5′的末端，結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)AOD攝入率明顯增加，高于其它修飾方法，且不影響

4、細(xì)胞的生長特性。說明AOD的5′末端連接PEG在反義治療領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景［6］。2　MDRl基因的反義RNA　　AOD的作用是封閉MDRl基因而影響基因的轉(zhuǎn)錄，反義RNA則是與MDRl基因的mRNA形成二聚體而抑制mRNA的翻譯。曹江等［7］利用高表達(dá)反義MDRl-RNA重組質(zhì)粒pRMAS轉(zhuǎn)染耐藥細(xì)胞K562/Dox后，其P-糖蛋白近乎陰性，細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素濃度與敏感細(xì)胞系K562幾乎一致，說明P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排幾乎完全被抑制，顯示將反義RNA的模板DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，可產(chǎn)生大量反義RNA抑制MDRl基因表達(dá)。資料還顯示細(xì)胞除對阿霉素的耐受性完全被逆轉(zhuǎn)外，對長

5、春新堿和柔紅霉素的耐受性仍保留9.0倍和14.1倍以上，說明P-糖蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)陰后，MDR并不能完全逆轉(zhuǎn)，提示還有其它機制作用于細(xì)胞的MDR。3　切割MDRlmRNA的核酶　　核酶(Ribozyme)是正常存在于細(xì)胞內(nèi)并調(diào)控基因表達(dá)的RNA，具有核苷酸內(nèi)切酶活性，能序列地切割靶RNA，抑制基因的表達(dá)。王寶成等設(shè)計合成的能切割MDRl-mRNA第196密碼子GUC序列的錘頭狀核酶定向克隆于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pDOR-neo的BamHI位點。經(jīng)病毒包裝細(xì)胞BA317包裝后感染人肝癌MDR細(xì)胞株BEL-7402/DOX細(xì)胞，RT-PCR證實轉(zhuǎn)化細(xì)胞中MDRl-mRNA與未轉(zhuǎn)化細(xì)

6、胞相比明顯減少甚至不能擴增出來。P-gp的表達(dá)，與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的93.4%～97.5%相比下降至8.2%～14.6%。并對多種化療藥物重新產(chǎn)生較高的敏感性。以上結(jié)果表明表達(dá)核酶的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)化BEL-7402/DOX細(xì)胞后能有效地抑制MDRl基因的表達(dá)，使已產(chǎn)生耐藥的腫瘤細(xì)胞的MDR表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)［8］。說明應(yīng)用核酶是逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR有效、特異性的方法。4　針對MDRl基因調(diào)節(jié)基因的基因治療4.1細(xì)胞因子基因　　Stein等［9］的研究發(fā)現(xiàn)機體免疫系統(tǒng)的一些細(xì)胞因子如TNF，IFN和IL-2可降低MDRl基因mRNA和P-gp的表達(dá)水平，增加細(xì)胞對MDR相關(guān)藥物阿

7、霉素(ADM)及VCR的敏感性。但細(xì)胞因子靜脈應(yīng)用可產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，將細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，在腫瘤局部微環(huán)境中產(chǎn)生和釋放細(xì)胞因子，可減輕全身應(yīng)用的副作用。為此，他們又將TNF和IL-2基因轉(zhuǎn)入人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞系HCT15和HCT116細(xì)胞中。結(jié)果顯示TNF和IL-2基因在人HCT15和HCT116細(xì)胞中的表達(dá)可降低MDRl-mRNA和P-gp的表達(dá)水平，使細(xì)胞內(nèi)ADM積累增加，細(xì)胞對ADM及VCR敏感性升高。說明TNF和IL-2基因的傳染和表達(dá)可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的MDR，聯(lián)合應(yīng)用基因治療和化療對耐腫瘤的治療具有潛在的價值［10］。4.2　抑癌基因和癌基因　　研