融合蛋白的純化ppt課件.ppt

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1、融合蛋白的純化1以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識(shí)，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析，有機(jī)溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過(guò)物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于不同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、堿、高溫，劇烈機(jī)械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失

2、或斷裂。2一、蛋白質(zhì)分離純化的一般程序1.破碎生物組織，并用適當(dāng)?shù)木彌_液將蛋白質(zhì)抽提出來(lái)；這也就是蛋白質(zhì)分離純化的前處理工作。當(dāng)然如果我們要分析分離的蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞的外分泌物中的時(shí)候，就無(wú)需對(duì)生物組織進(jìn)行破碎處理了，只需要用適當(dāng)?shù)木彌_溶液將蛋白質(zhì)抽提出來(lái)就行。2.用離心法將細(xì)胞的亞細(xì)胞顆粒（如核、線粒體、微粒體或核糖體）及細(xì)胞碎片與溶液分開。3.應(yīng)用鹽析法或有機(jī)溶劑法將有關(guān)蛋白質(zhì)組分沉淀下來(lái)。4.進(jìn)一步應(yīng)用層析法或電泳法使各種蛋白質(zhì)分開。5.在適當(dāng)條件下使蛋白質(zhì)結(jié)晶或制成凍干粉。34蛋白質(zhì)分離純化中的注意事項(xiàng)：1.首先要建立一個(gè)方便靈敏的分析方法。2.分離步驟要盡可能少

3、3.盡量避免蛋白質(zhì)在提純過(guò)程中的變性：包括六個(gè)方面5盡量避免蛋白質(zhì)在提純過(guò)程中的變性▼要求分離流程相當(dāng)快速，同時(shí)分離過(guò)程通常要保持在低溫（4℃）條件下進(jìn)行。▼盡量避免過(guò)度暴露于氧氣中▼注意重金屬離子對(duì)酶的失活作用▼避免一切過(guò)激因素（如過(guò)酸或過(guò)堿）對(duì)蛋白活性的影響▼提取液的濃度應(yīng)維持在較高水平▲最后，還需要注意的是：有少數(shù)蛋白質(zhì)需在高離子強(qiáng)度的極性介質(zhì)中保持活性，因此還需要想提取液中加入KCl、NaCl、(NH4)2SO466蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高

4、，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。72、等電點(diǎn)沉淀法　　蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的

5、等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。83、低溫有機(jī)溶劑沉淀法由于有機(jī)溶劑自由移動(dòng)的離子較少，具有較低的介電常數(shù)，所以會(huì)使溶液的介電常數(shù)減小，從而增強(qiáng)偶極離子之間的靜電引力，進(jìn)而使蛋白分子集聚沉淀。另一方面，有機(jī)溶劑如果是水溶性的話，本身的水合作用會(huì)破壞蛋白質(zhì)表面的水合層（爭(zhēng)奪水分子），也促使蛋白質(zhì)分子脫水而沉淀。9（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾　　透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。　　超濾法是利用高壓力或離心力，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。2、凝

6、膠過(guò)濾法　　也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadexgel）和瓊脂糖凝膠（agarosegel）。101112（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離1、電泳法　　各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳。13原理聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(IsoelectricFocusing-PAGE，簡(jiǎn)稱IEF-PAGE)：利用各種蛋白質(zhì)pI不同，以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體(carrierampholyt

7、es)，兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)作用下，按各自pI形成從陽(yáng)極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。在電場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時(shí)，就不再泳動(dòng)，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。14兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)(1)易溶于水，在pI處應(yīng)有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的pH梯度，不致被蛋白質(zhì)或其它兩性電解質(zhì)改變pH梯度。(2)在pI處應(yīng)有良好的電導(dǎo)及相同的電導(dǎo)系數(shù)，以保持均勻的電場(chǎng)。(3)分子量小，可通過(guò)透析或分子篩法除去，便于與生物大分子分開。(4)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)