GBT 19915.7-2005 豬鏈球菌 2型熒光 PCR檢測方法

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1、ICCs5307.100.30蕩黔中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T19915.7-2005豬鏈球菌2型熒光PCR檢測方法Methodofthereal-timePCRforthedetectionofStreptococcussuistype22005-09-27發(fā)布2005-11-01實(shí)施串替裳臀瓣譬篷臀臀暴發(fā)“GB/T19915.7-2005前言本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A是規(guī)范性附錄，附錄B是資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口．本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國北京出人境檢驗檢疫局

2、、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張鶴曉、宋立、高志強(qiáng)、寧宜寶、喬彩該、王甲正、楊承槐、吳丹、谷強(qiáng)。本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)。GB/T19915.7--2005豬鏈球菌2型熒光PCR檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬鏈球菌2型熒光PCR檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于增菌培養(yǎng)物、疑似病料及生豬拭子、豬組織樣品中豬鏈球菌2型的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使

3、用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢側(cè)方法3縮略語本標(biāo)準(zhǔn)采用下列縮略語：熒光PCR熒光聚合酶鏈反應(yīng)Ct值每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號盤達(dá)到設(shè)定的閱值時所經(jīng)歷的循環(huán)圈數(shù)DNA脫氧核糖核酸Taq酶TaqDNA聚合醉PBS磷酸鹽緩沖生理鹽水4原理采用TagMan方法，在比對豬鏈球菌2型英膜抗原21基因（cps2J）序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計針對該基因的特異性引物和特異性的熒光雙標(biāo)記探針進(jìn)行配對。探針5'端標(biāo)記FAM熒光素為報告熒光基團(tuán)（用R表

4、示）,3’端標(biāo)記TAMRA熒光素為淬滅熒光基團(tuán)（用Q表示），它在近距離內(nèi)能吸收5‘端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號。PCR反應(yīng)進(jìn)人退火階段時，引物和探針同時與目的荃因片段結(jié)合，此時探針上R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號被Q基團(tuán)所吸收，儀器檢測不到熒光信號；而反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時，Taq酶的5'-3’的外切核酸酶功能將探針降解。這樣探針上的R基團(tuán)游離出來，所發(fā)出的熒光不再為Q所吸收而被檢測儀所接收。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物與熒光信號的增長呈現(xiàn)對應(yīng)關(guān)系。5豬鏈球菌2型黃光PCR檢側(cè)實(shí)臉盆的標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)It與曹理豬鏈球菌2型熒光PCR檢

5、測實(shí)驗室的標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)置與管理見GB/T19438.1-2004中附錄C,6試荊和材料6.1試劑除另有說明，所用試劑均為分析純。6.1.1無水乙醇：一20℃預(yù)冷。6.1.275％乙醇：用新開啟的無水乙醉和無DNA酶的滅菌純化水配制，-200C預(yù)冷。6.1.30.0lmol/LpH7.2的PBS：配方見附錄A,(121士2)'C,15min高壓滅菌冷卻。GB/T19915.7-20056.1.4豬鏈球菌2型熒光PCR檢測試劑盒”：試劑盒的組成、說明及使用注意事項參見附錄B,6.2儀．設(shè)備6.2.1高速臺式冷凍離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速

6、13000r/rnin以上。6.2.2熒光PCR檢測儀、計算機(jī)。6.2.320C-8℃冰箱和一20℃冰箱。6.2.4徽量移液器：0.5IAL-10KL,5pL-20uL,20liL-200uL,200IAL-1000IiLa6.2.5組織勻漿器。6.2.6混勻器。7樣品的采集與前處理采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣及樣品前處理過程中須戴一次性手套。7.1取樣工其7.1.1棉拭子、剪刀、銀子、研缽、Eppendorf管。7.1.2所有上述取樣工具必須經(jīng)（121土2)9C,15min高壓滅菌并烘干或經(jīng)160℃干烤2ho7.

7、2采樣方法7.2.1生猜拭子樣品咽喉拭子采樣，采樣時要將拭子深人喉頭及上胯來回刮3次～5次，取咽喉分泌液。7.2.2扁挑體、內(nèi)臟或肌肉樣品用無菌的剪刀和攝子剪取待檢樣品1.0g于研缽中充分研磨，再加5.0mLPBS混勻，然后將組織懸液轉(zhuǎn)人無菌Eppendorf管中，編號備用。7.2.3血清或血槳用無菌注射器直接吸取至無菌Eppendorf管中，編號備用。7.3存放與運(yùn)送采集或處理的樣本在2VC-8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，須放置一70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（最多凍融3次）。采集的樣品密封后，采用保溫壺

8、或保溫桶加冰密封，盡快運(yùn)送到實(shí)驗室。8操作方法8.1樣本核咬的扭取在樣本處理區(qū)進(jìn)行。8.1.1提取方法18.1.1.1取n個1.5mL滅菌Eppendorf管，其中n為待檢樣品數(shù)、一管陽性對照及一管陰性對照之和，對每個管進(jìn)行編號標(biāo)記。8.1.1.2每管加人1.0mL裂解液，然后分別加入待測樣本、陰性對照和陽性對照各100pL，一份