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1、ICS07.100.30C53(Gs中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T19915.4-2005豬鏈球菌2型三重PCR檢測方法MethodofdetectingStreptococcussuistype2bytriple-PCR2005-09-27發(fā)布2005-11-01實(shí)施中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)GB/T19915.4-2005oli青豬鏈球菌2型是鏈球菌屬的成員，其致病菌株可致豬鏈球菌病，引起豬敗血癥、腦膜炎等。人可通過傷口感染該菌，并導(dǎo)致死亡。為了區(qū)別正常豬所攜帶的豬鏈球菌2型無毒菌株與發(fā)病
2、豬分離的致病菌株，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)是采用現(xiàn)代分子生物學(xué)診斷技術(shù)制定的。本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:陸承平、姚火春、范紅結(jié)、何孔旺。GB/T19915.4-2005豬鏈球菌2型三重PCR檢測方法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬鏈球菌2型莢膜基因(cps2),溶菌酶釋放蛋白基因(mrp)和orf2這三個(gè)毒力基因的三重PCR檢測技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于由豬鏈球菌2型致病基因和致病菌株的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注
3、日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T6682-1992分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1豬鏈球菌2型Streptococcussuistype2豬鏈球菌是屬于鏈球菌屬的一種細(xì)菌，根據(jù)其莢膜多糖抗原的差異，可分為1^-34及1/2共35個(gè)血清型。豬鏈球菌2型是豬鏈球菌的一個(gè)血清型，不僅對豬致病性很強(qiáng)，而且可以感染特定的人群，是一種重
4、要的人畜共患病病原菌。測定方法4.1方法提要挑取可疑細(xì)菌培養(yǎng)物菌落，加人PCR反應(yīng)管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，與標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記比較，來確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。4.2試劑和材料除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682-1992的滅菌雙蒸水。4.2.1cps2,mrp和orf2的上下游引物，按合成說明書使用。4.2.2TaqDNA聚合酶。4.2.3瓊脂糖:電泳級。4.2.4澳化乙錠。4.2.5分子量標(biāo)記:DL-2000,4.2.6TE緩沖液:10mmol/LTris-HCI(pH8.0),lmmol/
5、LEDTA(pH8.0),4.2.7IOXPCR緩沖液:100mmol/LKC1,160mmol/L(NH,)2SO1,20mmol/LMgSO,,200mmol/LTris-HCI(pH8.8),1%TritonX-100,1mg/mLBSA,4.2.8電泳緩沖液:242gTris堿，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加蒸餾水至1000mL，使用時(shí)10倍稀釋。4.2.9加樣緩沖液:0.25澳酚藍(lán)，40%蔗糖。4.2.10陽性對照豬鏈球菌2型HA9801株基因組DNA模板，陰性對照馬鏈球菌獸疫亞種
6、ATCC35246株和金黃色葡萄球菌ATCC25923株基因組DNA模板。GB/T19915.4-20054.2.11豬鏈球菌2型三重PCR反應(yīng)混合物。4.3儀器和設(shè)備4.3.，離心機(jī)。4.3.2DNA熱循環(huán)儀。4.3.3核酸電泳儀。4.3.4pH計(jì)。4.3.5移液器:10pL,20pL,100pL,l000pL,4.3.6紫外線透射儀或捉膠成像系統(tǒng)。4.3.7恒溫水浴鍋。4.4PCR操作步驟4.4.1陽性對照和陰性對照DNA模板的提取分別將豬鏈球菌2型HA9801、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株和金黃色葡萄球菌ATCC259
7、23株接種于5%犢牛血清Todd-Hweitt肉湯培養(yǎng)基，37℃搖振培養(yǎng)18h，用革蘭氏陽性細(xì)菌柱離心式基因組DNA小量抽提試劑盒提取DNA模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?.4.2PCR擴(kuò)增用鉑金耳釣取血平板上的可疑單菌落至含有豬鏈球菌2型三重PCR反應(yīng)混合物的PCR管中，混勻，加人Taq酶(2U/(aL)0.7pL,2000r/min離心10s，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增;同時(shí)設(shè)去離子水的空白對照、豬鏈球菌2型HA9801株基因組DNA模板的陽性對照、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246和金黃色葡萄球菌ATCC25923株基因組DNA模板的陰性對
8、照。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5min;940C30s,55`C30s,72*C40s,30個(gè)循環(huán);720C延伸7min,VC保存。4.4.3瓊脂精凝膠電泳在電泳緩沖液中加人1%瓊脂糖，加熱融化后加人澳化乙錠制備凝膠，凝固后進(jìn)行電泳。8
