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1、ICS07.100.30一一C53溥羚中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GBJT19915.9-2005豬鏈球菌2型溶血素基因PCR檢測方法DetectionmethodofthehemolysingeneforStreptococcussuistype2byPCR2005-09-27發(fā)布2005-11-01實(shí)施率督留瞥臀瓣譬篷臀臀暴發(fā)“GB/T19915.9-2005Hi青豬鏈球菌2型是鏈球菌屬的成員，其致病菌株可致豬鏈球菌病，引起豬敗血癥、腦膜炎等。近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病流行日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。人可通過傷口感
2、染該菌，并導(dǎo)致死亡。溶血素是豬鏈球菌2型一種重要毒力因子。通過檢測豬及其產(chǎn)品中分離菌株是否含有豬鏈球菌2型溶血素基因，可以作為區(qū)分豬鏈球菌2型無毒菌株與致病菌株的一個(gè)指標(biāo)，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：中華人民共和國江蘇出人境檢驗(yàn)檢疫局、中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳國強(qiáng)、唐泰山、張敬友、姜眾、王凱民、張常印、林祥梅、吳紹強(qiáng)、劉建、韓雪清、賈廣樂、梅琳。GB/T19915.9-2005豬鏈球菌2型溶血素基
3、因PCR檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬鏈球菌2型溶血素基因PCR檢測的操作方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬及其產(chǎn)品中分離菌株的豬鏈球菌2型溶血素基因的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T6682-1992分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1豬鏈球菌2型Str
4、eptococcussuistype2豬鏈球菌是屬于鏈球菌屬的一種細(xì)菌，根據(jù)其莢膜多糖抗原的差異，可分為1^34及1/2共35個(gè)血清型。豬鏈球菌2型是豬鏈球菌的一個(gè)血清型，不僅對(duì)豬致病性很強(qiáng)，而且可以感染特定的人群，是一種重要的人畜共患病病原菌。4縮略語PCRpolymerasechainreaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNAdeoxyribonucleicacid，脫氧核糖核酸dNTPdeoxyribonucleosidetriphosphate，脫氧核昔酸三磷酸bybasepair，堿基對(duì)5測定方法5.1方法提要以可疑細(xì)
5、菌培養(yǎng)物提取的核酸，作為DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，與標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記比較，來確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。5.2試劑和材料除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682-1992的滅菌雙蒸水。5.2.1豬鏈球菌2型溶血素基因PCR反應(yīng)混合物：10XPCR緩沖液2.5KL,25mmol/LM9Cl22.0p.L,2.5mmol/LdNTP2uL、上下游引物各1I}AL，用雙蒸水補(bǔ)至20tkL。引物序列如下，其目的片段長度為495byoslyl：5'000,AAG,TTC,AAG,CCG,CAT,TT
6、A3'（1542)sly2：5'GAA,GAT,TGC,GAG,CAT,TTC,CTG3'(2036)5.2.2TaqDNA聚合酶。GB/T19915.9-20055.2.3瓊脂糖：電泳級(jí)。5.2.4澳化乙錠。5.2.5酚：Tris飽和。5.2.6三氯甲烷。5.2.7異戊醇。5.2.8異丙醇。5.2.970％乙醇。5.2.10分子量標(biāo)記：DL-2000.5.2.11十六烷基三甲基澳化按(CTAB）提取液：0.1mmol/LTris-HCl(pH7.5),10mmol/LEDTA(pH7.5),200CTAB,0.7mmol/
7、LNaCl,1Yo日一琉基乙醇。5.2.12TE緩沖液：10mmol/l.Tris-HCI(PH8.OMmmol/LEDTA(pH8.0),5.2.1310XPCR緩沖液：100mmol/LKCI,160mmol/L(NH4)2SO4,20mmol/LMgS04,200mmol/LTris-HCI(pH8.8)，1％TritonX-100，1mg/mLBSA,5.2.14電泳緩沖液：242gTris,57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加蒸餾水至1000mL；使用時(shí)10倍稀釋。5.2.15加
8、樣緩沖液：0.25澳酚藍(lán)，40％蔗糖。5.3儀器和設(shè)備5.3.1離心機(jī)。5.3.2DNA熱循環(huán)儀。5.3.3核酸電泳儀。5.3.4pH計(jì)。5.3.5移液器：10liL,20p.L,100pL,l000tiL,5.3.6紫外線透射儀或凝膠成像系統(tǒng)。5.3.7恒溫水浴鍋。5.4操作步驟5.4.
