GBT19915.5-2005 豬鏈球菌 2型多重 PCR檢測(cè)方法 - 下載地址.pdf

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1、ICCS5307.100.30靄黔中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T19915.5-2005豬鏈球菌z型多重PCR檢測(cè)方法ProtocolofmultiplexPCRidentificationofStreptococcussuistype22005-09-27發(fā)布2005-11-01實(shí)施率督冒瞥臀瓣譬壕臀臀暴發(fā)“GB/T19915.5-2005前片習(xí)本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：韓雪清、林祥梅、吳紹強(qiáng)、劉建、賈廣樂、梅琳、陳國強(qiáng)、張敬友、姜眾、唐

2、泰山。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。GB/T19915.5-2005豬鏈球菌2型多重PCR檢測(cè)方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬鏈球菌2型多重PCR檢測(cè)的操作方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測(cè)生豬拭子、增菌培養(yǎng)物、疑似病料及豬組織樣品（豬淋巴結(jié)、扁桃體、肉品等）中的豬源鏈球菌及豬鏈球菌2型。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T6682-1992分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方

3、法。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1豬鏈球菌2型Streptococcussuestype2豬鏈球菌是屬于鏈球菌屬的一種細(xì)菌，根據(jù)其莢膜多糖抗原的差異，可分為1-34及1/2共35個(gè)血清型。豬鏈球菌2型是豬鏈球菌的一個(gè)血清型，不僅對(duì)豬致病性很強(qiáng)，而且可以感染特定的人群，是一種重要的人畜共患病病原菌。3.2多皿聚合陣鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（多皿PCR)multiplexpolymerisechainreaction多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系中加上兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片斷的PCR反應(yīng)。4縮略語本標(biāo)準(zhǔn)采用下列縮略語：PCR聚合酶

4、鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA脫氧核糖核酸dNTP脫氧核酸三磷酸by堿基對(duì)5試荊和材料除另有規(guī)定外，所用生化試劑均為分析純，水為符合GB/T6682-1992的滅菌雙蒸水或超純水。5.1豬鏈球菌2型多重PCR反應(yīng)混合物PCR緩沖液（含Mg"),2fzL;dNTP,1.6IL；引物1,0.6tLL；引物2,0.6IL；引物3,0.6juL；引物4,0.6fL；菌液1.5IiL;酶0.2KL；水12.3pL；總體積20IL,5.2TaqDNA聚合酶5.310XPCR緩沖液100mmol/LKCI，160mmol/L（NH4)ZSO4，20mmol/LMgS04，200mmol/LTris-HC

5、IGB/T19915.5-2005(pH8.8)，1％TritonX-100，lmg/mLBSA,5.4dNTP混合液（各2.5mmol/L)5.5瓊脂糖：電泳級(jí)5.6澳化乙錠5.7DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)5.8TE緩沖液10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/l.EDTA,5.9核酸電泳緩沖液Tris堿242g，冰乙酸57.1mL,O.5mol/LEDTA100mL，加蒸餾水至1000mL，使用時(shí)10倍稀釋。5.10電泳加樣緩沖液0.25％澳酚藍(lán)，40蔗糖。5.11樣品對(duì)照豬鏈球菌2型菌DNA提取物分別作為陽性對(duì)照，馬鏈球菌獸疫亞種DNA提取物為陰性對(duì)照。6儀

6、器和設(shè)備6.1臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（X13000r/min).6.2DNA熱循環(huán)儀。6.3核酸電泳儀和水平電泳槽。6.4凝膠成像系統(tǒng)（或紫外透射儀）。6.5可調(diào)移液器一套：10pL、20pL,200pL和1000pL,6.6恒溫水浴箱。7操作方法7.1方法概要取培養(yǎng)菌液或從組織中提取的基因組DNA作為模板，加人到擴(kuò)增豬鏈球菌和豬鏈球菌2型的PCR反應(yīng)混合液中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；或直接將待檢細(xì)菌培養(yǎng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行比較，來確定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，在此基礎(chǔ)上判定樣品的檢測(cè)結(jié)果。7.2樣品采集在實(shí)驗(yàn)室生物安全柜中操作，將采集的組

7、織樣本剔除包膜和其他結(jié)締組織，選取內(nèi)部實(shí)質(zhì)部分，凍存于一20℃?zhèn)溆谩?.3組織樣本DNA的制備采用商品化的組織基因組DNA提取試劑盒，按說明書進(jìn)行操作。7.4多孟PCR擴(kuò)增將培養(yǎng)的細(xì)菌純培養(yǎng)物樣品（不經(jīng)過離心）1.2yL、或者將制備的各樣品DNA以及陽性和陰性對(duì)照DNA各l.5j.L分別加人到含有豬鏈球菌2型菌的PCR反應(yīng)混合液的相應(yīng)PCR反應(yīng)管中〔緩沖液（含Mg2+),2pL;dNTP,1.6p.L；引物1,0.6IiL，引物2,0.6t.L，引物3,0.6I.L，引物4,0.6(AL;酶0.2tLL；加水至總體