掌葉覆盆子的化學(xué)成分及其活性研究.docx

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1、掌葉覆盆子的化學(xué)成分及其活性研究掌葉覆盆子作為一種藥食同源品種,具有多種生物活性,極具研究開(kāi)發(fā)前景。掌葉覆盆子中有效成分復(fù)雜,至今尚未完全明晰。對(duì)掌葉覆盆子的功能性成分的研究還有待進(jìn)一步深入探討,以促進(jìn)覆盆子資源的開(kāi)發(fā)與利用。本論文通過(guò)現(xiàn)代色譜及波譜技術(shù)分離和鑒定掌葉覆盆子的有效成分,闡明了掌葉覆盆子中主要活性物質(zhì),包括揮發(fā)性成分、活性小分子化合物以及多糖等;探討了一種黃酮苷類化合物的抗炎作用機(jī)制;闡明了一種三萜類化合物抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制;探索了覆盆子多糖的提取純化、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)分析以及活性評(píng)價(jià)。本研究有助于闡明掌葉覆盆子藥食兩用的物質(zhì)基礎(chǔ),并且可以對(duì)其高附加值

2、產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論支持和方法的指導(dǎo)。(1)通過(guò)水蒸氣蒸餾法、索氏乙醇提取法和索氏乙醚提取法分別提取覆盆子果實(shí)中揮發(fā)性成分,提取率依次為0.15%、2.12%和1.98%。利用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)分離鑒定其中的揮發(fā)性成分,三種不同的提取方法從覆盆子果實(shí)中共分離鑒定出58種揮發(fā)性成分,其中包括8類化合物:9種飽和烴類、10種不飽和烴類、9種醇類、2種羰基類化合物、11種酯類、7種有機(jī)酸類、8種氧化物類及兩種其它類化合物。用水蒸氣蒸餾法、索氏乙醇提取法和索氏乙醚提取法提取得到的覆盆子揮發(fā)油分別分離鑒定出54、47和41種化合物。索氏乙醚提取法得到的覆盆子揮發(fā)油含有較多的飽和烴類化合

3、物與酯類化合物。在三種揮發(fā)油中,通過(guò)索氏乙醚提取法提取得到的覆盆子揮發(fā)油具有較強(qiáng)的溶血抑制效果,顯著高于陽(yáng)性對(duì)照肝素鈉在相同濃度下的溶血抑制率,這可能與其含有更多的酯類化合物相關(guān);通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取得到的覆盆子揮發(fā)油抑制人肺癌細(xì)胞(A549)增殖的效果最好,這可能與其含有大量的不飽和脂肪酸有關(guān)。(2)提取分離得到覆盆子四大類活性物質(zhì)(多糖、黃酮、皂苷和生物堿)并對(duì)其進(jìn)行了抗氧化、抗補(bǔ)體以及抗腫瘤活性評(píng)價(jià),研究結(jié)果表明,覆盆子總黃酮具有良好的抗氧化活性和卓越的抗補(bǔ)體活性,同時(shí)還具有顯著的抗腫瘤活性,說(shuō)明黃酮富集了本植物有效活性成分。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)得

4、到覆盆子黃酮提取的最佳工藝條件為:提取溫度75℃,時(shí)間為2.5h,乙醇濃度為30%,液固比為20:1。在此條件下,覆盆子總黃酮平均提取率為3.2%,與理論相符。通過(guò)硅膠柱層析和重結(jié)晶從覆盆子黃酮中分離純化得到了一種主要化合物,鑒定為椴樹(shù)苷。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn),探討了椴樹(shù)苷對(duì)A549肺癌細(xì)胞增殖能力的影響,結(jié)果表明椴樹(shù)苷對(duì)人肺癌細(xì)胞A549有明顯的抑制作用,并且呈現(xiàn)出濃度依賴性。經(jīng)AnnexinV-FITC/PI雙染以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析,椴樹(shù)苷是通過(guò)誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。(3)采用95%乙醇加熱回流提取的方法,減壓濃縮得到覆盆子95%乙醇粗提取物,有機(jī)溶劑分級(jí)萃取得到

5、四個(gè)極性部位:石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物?；钚栽u(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,覆盆子乙酸乙酯萃取物不僅具有良好的抗氧化活性和卓越的抗炎活性,還具有顯著的抗腫瘤活性,說(shuō)明覆盆子95%乙醇粗提取物經(jīng)過(guò)不同極性的有機(jī)溶劑分級(jí)萃取后,活性成分主要集中在乙酸乙酯部位。利用柱色譜層析法和高效液相分析等分離純化手段對(duì)覆盆子乙酸乙酯部位進(jìn)行了系統(tǒng)全面的分離純化,共得到9個(gè)單體化合物,分別為:對(duì)映-16α,17-二羥基-貝殼杉-19-羧酸、委陵菜酸、齊墩果酸、槲皮苷、金絲桃苷、椴樹(shù)苷、β-胡蘿卜苷、紫云英苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷。其中化合物對(duì)映-16α,17-二羥基-貝殼杉-19-羧酸和

6、委陵菜酸為首次從覆盆子中分離得到。(4)覆盆子中提取得到的黃酮苷類化合物(槲皮苷、金絲桃苷、椴樹(shù)苷和紫云英苷)均表現(xiàn)出一定程度的NO抑制作用,并呈現(xiàn)濃度依賴性;其中,椴樹(shù)苷具有極好的抗炎活性,當(dāng)濃度為100μg/mL時(shí),其NO釋放抑制率為30.4%,接近于50μg/mL地塞米松(DXM)的抗炎效果。研究表明椴樹(shù)苷可能是通過(guò)巨噬細(xì)胞內(nèi)MAPKs/NFκ-B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制TNF-α、iNOS、IL-6mRNA等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄從而進(jìn)一步抑制NO及相關(guān)炎癥因子的產(chǎn)生,最終起到抗炎作用。(5)通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn),探討了從覆盆子中分離純化得到的單體化合物對(duì)4種腫瘤細(xì)胞和1種正常細(xì)胞的增殖能力的影響,

7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明委陵菜酸(tormenticacid)對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用尤為顯著,并表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞選擇性。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析,委陵菜酸抑制MCF-7細(xì)胞增殖是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G0/G1期阻滯來(lái)實(shí)現(xiàn)的。委陵菜酸能夠促使MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,過(guò)量的ROS會(huì)攻擊線粒體,使MCF-7細(xì)胞內(nèi)線粒體跨膜電位(ΔΨm)下降而導(dǎo)致線粒體功能紊亂;同時(shí),委陵菜酸能夠激活Caspase-9和Caspase-3的活化,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另