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《益生菌制劑對(duì)雛雞盲腸菌群的部分作用機(jī)制》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、益生菌制劑對(duì)雛雞盲腸菌群的部分作用機(jī)制 在畜牧業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中,利用抗生素治療和預(yù)防疾病帶來(lái)的種種弊端逐漸被人們所認(rèn)識(shí),2006年歐盟決定禁止使用任何抗生素作為飼料添加劑。益生菌作為一類能通過(guò)調(diào)控生物體微生態(tài)平衡進(jìn)而有效促進(jìn)宿主健康生長(zhǎng)的活微生物制劑,一直被認(rèn)為是抗生素的最佳替代者之一。關(guān)于對(duì)雛雞腸道菌群的研究已有較多,但是關(guān)于益生菌和抗生素對(duì)肉雛雞盲腸菌群發(fā)育規(guī)律的影響作用還鮮有報(bào)道。本研究以屎腸球菌和金霉素為試驗(yàn)材料,通過(guò)對(duì)不同日齡肉雛雞盲腸內(nèi)容物的16SrDNAV3區(qū)進(jìn)行PCR-DGGE指紋圖譜比較分析,從不同角度研究益生菌制劑的部分作用機(jī)
2、制以及日糧中添加抗生素的可能影響?！ ?、材料與方法 1.1試驗(yàn)材料與試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)材料為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專利菌株(專利號(hào):ZL201110452087.2)屎腸球菌HDRsEf1株,湖北華大瑞爾科技有限公司生產(chǎn),每克菌粉的活菌數(shù)≥30億?！ ≡囼?yàn)動(dòng)物為1日齡健康白羽肉雞科寶500,購(gòu)自湖北宜昌正大有限公司?！ ?.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集 1)屎腸球菌定植動(dòng)物試驗(yàn)。選用1日齡健康白羽肉雞80只隨機(jī)分成對(duì)照組(玉米-豆粕基礎(chǔ)日糧)和益生組(添加300g屎腸球菌菌粉/1000kg),每組分別在1、3、5、7、9、11日齡
3、時(shí)頸靜脈放血處死5只雛雞,在超凈臺(tái)內(nèi)快速采集盲腸內(nèi)容物并混合,置4℃冰箱備用?！ ?)屎腸球菌和抗生素對(duì)雛雞腸道菌群的影響試驗(yàn)。試驗(yàn)選用1日齡新生白羽肉雞180只,隨機(jī)分成對(duì)照組(玉米-豆粕基礎(chǔ)日糧)、益生組(添加300g屎腸球菌菌粉/1000kg)和抗生素組(添加50mg金霉素/kg)。每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)20只雞。試驗(yàn)周期為42d,每組分別在7、14、21、28、35、42日齡時(shí)頸靜脈放血處死6只試驗(yàn)雞,在超凈臺(tái)內(nèi)快速采集盲腸內(nèi)容物,將每個(gè)組的6只雛雞內(nèi)容物混合,置4℃冰箱備用?！ ?.3細(xì)菌總DNA的提取 參照文獻(xiàn),采用QIAampD
4、NAStoolMiniKit,按照操作手冊(cè)提取細(xì)菌總DNA。用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定總DNA濃度,置-20℃保存?zhèn)溆?。 ?.4RT-PCR 法檢測(cè)盲腸中屎腸球菌、大腸桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的引物見(jiàn)表1。檢測(cè)屎腸球菌數(shù)量的熒光定量PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s,60℃延伸30s,40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)大腸桿菌和乳酸桿菌數(shù)量的熒光定量PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s,55℃退火20s,72℃延伸30s,40個(gè)循環(huán)。每次熒光定量PCR循環(huán)結(jié)束后溶解曲線從65℃逐步升到95℃。熒光定量PCR體系的
5、最終體積控制在20μL,反應(yīng)試劑均按PremixExTaqTM試劑說(shuō)明書的推薦量添加?！ ?.5基因組特異性片段 V3區(qū)的擴(kuò)增為了檢測(cè)各組腸道菌群的變化情況,用引物GC341f(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATTACCGCGGCTGCTGG-3′)和519r(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)擴(kuò)增16SrRNA的V3區(qū)片段,擴(kuò)增條件是94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,55℃退火20s,72℃延伸30s,35個(gè)
6、循環(huán);最后72℃延伸10min。 PCR反應(yīng)體系(25μL):2PCRmix12.5μL,上下游引物(10pmol/L)各1μL,DNA模板2μL,ddH2O補(bǔ)足至25μL?！ ?.6基因組特異性片段 V3區(qū)的變性梯度凝膠電泳(DGGE)使用Bio-RadDcode進(jìn)行DGGE凝膠電泳?！ ∽冃詣┨荻确秶鸀?8%~55%,100%的變性劑包含7mol/L尿素和40%去離子甲酰胺。電泳在恒溫60℃條件下1TAE緩沖液中進(jìn)行,先200V預(yù)電泳10min,然后65V電壓電泳16h。參照文獻(xiàn)[7]方法用硝酸銀染色,對(duì)完
7、成顯色后的凝膠拍照,再用相應(yīng)軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分析?！ ?.7數(shù)據(jù)分析 采用UPGMA進(jìn)行聚類分析,以香農(nóng)多樣性指數(shù)H′表示菌群多樣性的高低,SPSS18.0進(jìn)行PCA分析和顯著性差異分析?！ ?、結(jié)果與分析 2.1益生性屎腸球菌 HDRsEf1株在雛雞腸道菌群定植的確定如圖1所示,隨著雛雞日齡的增加,益生菌組中雛雞盲腸中的屎腸球菌的數(shù)量逐漸增加,到第5日齡時(shí)基本達(dá)到穩(wěn)定,而對(duì)照組的屎腸球菌的數(shù)量在5日齡以后逐漸降低,說(shuō)明該株屎腸球菌HDRsEf1可以在雛雞盲腸內(nèi)定植,并且在5日齡時(shí)就基本達(dá)到穩(wěn)定?！ ?.2大腸桿菌和乳酸桿菌
8、數(shù)量的檢測(cè) 由表2可見(jiàn),飼料中添加屎腸球菌HDRsEF1和抗生素可以顯著減少21日齡時(shí)雛雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量(P<0.05),而在42日齡時(shí)
