涂片與培養(yǎng)及pcr-rlb檢測(cè)淋病奈瑟菌的比較研究

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1、涂片與培養(yǎng)及PCR/RLB檢測(cè)淋病奈瑟菌的比較研究作者：何大源，向華國(guó)，楊波，黃玉佳【摘要】目的：建立以16SrRNA為靶基因的PCR反向線點(diǎn)雜交技術(shù)（RLB）檢測(cè)淋病奈瑟菌（NEisseriagonorrhoeae,NG），并與涂片法及培養(yǎng)法比較。方法：選擇NG16SrRNA基因設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，生物素標(biāo)記下游引物擴(kuò)增NGDNA，然后與固定在尼龍膜上的特異性寡核苷核探針雜交。并對(duì)115例性病高危人群標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，然后與涂片法與培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：PCR擴(kuò)增NGDNA的片段長(zhǎng)度分別為414bp。通過對(duì)115例臨床標(biāo)本的檢測(cè)，PCR/RLB

2、的陽(yáng)性率為31.3%,而涂片法和培養(yǎng)法的陽(yáng)性率分別為15.7%和21.7%。結(jié)論：PCR/RLB是一種快速、敏感的檢測(cè)方法，對(duì)NG感染的實(shí)驗(yàn)診斷具有十分重要的意義?！娟P(guān)鍵詞】聚合酶鏈反應(yīng)；核酸雜交；淋病奈瑟氏菌　　Thestudyofparingear,CultureandPCRreverseLineHybridizationAssayforDetectingNEIsseriaGonorrhoeae　Abstract：ObjectiveTodevelop16SrRNAPCRreverselineblothybridization(RLB)assay

3、fordetectionofN.gonorrhoeaeandpareitearandculturemethods.MethodsTheDNAfromN.gonorrhoeaeplifiederforthe16SrRNAgene.Thereverseprimersidogeninanylonmembrane.ThenusingPCRRLBtodetect115specimensandpareitearandculturemethods.ResultsThelengthofPCRproductsear(15.7%)andculture(21.7%)(P&

4、lt;0.05).ConclusionTheresultsofPCRRLBindetectingN.gonorrhoeaealsoprovidedexcellentresults.Itplaystheveryimportantroleindetectingofclinicalpathogens.Keyerasechainreaction;Nucleicacidhybridization;Neisseriagonorrhoeae淋病是由淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae，NG）感染引起的一種常見的性傳播疾?。⊿TD），約占全球STD病

5、例的3/4，在我國(guó)亦呈逐步蔓延之勢(shì)［1］。流行病學(xué)資料顯示NG感染是加速HIV傳播的危險(xiǎn)因素，所以選擇更加特異、敏感的檢測(cè)方法對(duì)于NG的準(zhǔn)確診斷及HIV的防治都具有十分重要的意義［2］。近年來(lái)核酸擴(kuò)增技術(shù)在NG感染檢測(cè)方面得到了廣泛的應(yīng)用,特別是PCR技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，核酸擴(kuò)增技術(shù)具有較高的敏感性和易于標(biāo)本收集轉(zhuǎn)運(yùn)。本文利用以16SrRNA基因作為靶基因設(shè)計(jì)PCR引物,再結(jié)合反向線點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)115份臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并將結(jié)果與涂片法和培養(yǎng)法進(jìn)行比較。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1標(biāo)本來(lái)源　　115份性病高危人群標(biāo)本來(lái)源于深圳市福

6、永醫(yī)院門診患者，每人同時(shí)收集3份標(biāo)本，1份做涂片，1份做培養(yǎng)，1份做PCR/RLB檢測(cè)?！　?.1.2主要試試劑與儀器　　BiobyneC尼龍膜由Pall公司生產(chǎn)，鏈親和素過氧化物酶接合物由Roch公司生產(chǎn)，Taq酶、dNTP購(gòu)自MBI公司。Eppendorf公司PCR擴(kuò)增儀和Shellab雜交箱。　　1.2方法　　1.2.1涂片　　標(biāo)本涂片自然干燥后，革蘭染色鏡檢，找到多核白細(xì)胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌者為陽(yáng)性。　　1.2.2細(xì)菌培養(yǎng)　　標(biāo)本同時(shí)接種于血瓊脂平板和選擇性淋病奈瑟菌培養(yǎng)基，置5%~10%燭缸內(nèi)，在36.5℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h~36h，觀察結(jié)果，

7、根據(jù)菌落形態(tài)，過氧化物酶陽(yáng)性，并且涂片鏡檢為革蘭陰性球菌者為陽(yáng)性?！　?.2.3DNA提取　　將標(biāo)本置于含有100μlPCR裂解液（含10mmPH8.0的Tris,4.5%TritonX100,4.5%Tin后離心備用?！　?.2.4PCR　　反義引物5'端為生物素標(biāo)記，特異性探針5'端用氨基標(biāo)記（見表1）。PCR反應(yīng)體系25μl，含10buffer2.5μl，42.5mmol/LdNTP2μl，25mol/LMgCl21.5μl,5U/μlTaq酶0.2μl，50pmol引物各0.2μl，模板5μl，補(bǔ)水至25μl。反應(yīng)條件：95℃5min后，95

8、℃0.5min、58℃0.5min、72℃1min、35個(gè)循環(huán)，最后72℃5min。表1淋病奈