固相萃取反相高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定擬南芥中的生長(zhǎng)素論文

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1、固相萃取反相高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定擬南芥中的生長(zhǎng)素論文符繼紅褚金芳王吉德閆存玉【摘要】建立了固相萃取反相高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定擬南芥中生長(zhǎng)素的方法。采用S)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LCMS)技術(shù)。但是GCMS方法要求樣品的衍生化以提高揮發(fā)性和靈敏度，樣品處理過程復(fù)雜費(fèi)時(shí)。LCMS/MS技術(shù)雖然有較高的靈敏度和選擇性，同位素內(nèi)標(biāo)物的使用使其定量更為準(zhǔn)確3～7。但由于儀器和內(nèi)標(biāo)物的昂貴，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。高效液相色譜(HPLC)是一種通用的分析儀器，其在植物激素測(cè)定研究中已有報(bào)道，但因生物體內(nèi)激素的復(fù)雜性與特殊性，使其有效成分的提

2、取分離成為極為關(guān)鍵的一步。HPLC法測(cè)定多種植物內(nèi)源激素時(shí)經(jīng)常發(fā)生分離差、峰型不良及嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象8，且樣品用量一般要求較多9,10，對(duì)一些特殊樣品無法實(shí)現(xiàn)測(cè)試要求。因此，選擇合適的植物激素提取方法和色譜條件尤為重要。本研究建立的固相萃取高效液相色譜(HPLC)熒光檢測(cè)法可以準(zhǔn)確測(cè)定植物中的生長(zhǎng)素類物質(zhì)，樣品用量少，可以滿足普通分析實(shí)驗(yàn)室完成相關(guān)測(cè)試的要求。擬南芥(Arabidopsisthaliana)屬被子植物，雙子葉分綱，屬十字花科。因其具有生命周期短、自花授粉、核基因組小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是植物細(xì)胞遺傳學(xué)研究的經(jīng)典模式材料11。建立擬南芥

3、中植物激素生長(zhǎng)素含量的測(cè)定方法對(duì)有關(guān)生長(zhǎng)素作用機(jī)制及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究具有重要意義。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑2695高效液相色譜儀(美國(guó)K2超純水儀(ELGA公司)制備的超純水;擬南芥(中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所種植，生長(zhǎng)期12d，長(zhǎng)日照，16h光照，8h黑暗。溫度21～23℃，濕度50%～60%，光照強(qiáng)度80～120μmol/(s·m2)。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制根據(jù)擬南芥中生長(zhǎng)素含量范圍確定標(biāo)樣濃度9。準(zhǔn)確稱取0.05357g吲哚乙酸和0.06458g吲哚丙酸，用80%甲醇溶解并定容至25mL，配制成2.14g/L吲哚乙酸

4、和2.58g/L吲哚丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。相應(yīng)低濃度生長(zhǎng)素標(biāo)準(zhǔn)液用80%甲醇稀釋而成。2.2.2色譜條件S是研究IAA使用最廣泛的分析儀器，但樣品處理要經(jīng)過繁瑣的純化和衍生過程13,14，處理過程中樣品損失量很大，不利于建立高通量的生長(zhǎng)素測(cè)定方法。尋找一種快速、靈敏度高，成本低的方法，以期能在短時(shí)間內(nèi)處理多個(gè)樣品非常必要。與傳統(tǒng)的GCMS定量分析方法相比15,.freelolecularBiologyofPlants，Rockville，MD，AmericanSocietyofPlantBiologists，2000：8502YangShiJie(

5、楊世杰主編).PlantBiology(植物生物學(xué)).Beijing(北京)：SciencePress(科學(xué)出版社)，2000：2243MüllerA，DüchtingP，urchSJ，O′BrienR，SaxenaPK.J.Chromatogr.A，2006，1134：333～3376PanX，aZ，GeL，LeeASY，YongJodernMethodsofPlantAnalysis:Neany,1987：72～9113VineJH，NoitonD，PlummerJA，BaleriolaLucasC，MullinsMG.PlantPhys

6、iol.，1987，85：419～42214KambojJS，BrosSR，AmbroseSJ.PlantJ.，2003，35：405～41717BirkemeyerC，KolasaA，KopkaJ.J.Chromatogr.A，2003，993：89～102