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1、土貝母皂苷體外抗乙型肝炎病毒的藥效研究論文周艷萌，吳中明，向曉波【關(guān)鍵詞】土貝母皂苷；,,2．2．15細(xì)胞；,,乙型肝炎病毒；,,體外摘要：目的觀察土貝母皂苷體外抗乙型肝炎病毒(HBV)效果。方法以2．2．15細(xì)胞為靶細(xì)胞，給藥后通過檢測(cè)細(xì)胞表面及培養(yǎng)液中HBsAg，HBeAg和HBVDNA，觀察土貝母皂苷抗HBV效果。結(jié)果土貝母皂苷各濃度組對(duì)HBsAg，HBeAg表達(dá)均有抑制作用，但以0.1mg/ml作用48h時(shí)最強(qiáng).freelg/ml組顯著（P0.05）。結(jié)論土貝母皂苷在體外有抗乙型肝炎病毒(HBV)作用。關(guān)鍵詞：土貝母
2、皂苷；2．2．15細(xì)胞；乙型肝炎病毒；體外Abstract：ObjectiveTostudytheeffectofantiHBVactivityinvitro．MethodsTheantiHBVactivityofTubeimosideanhepatocellularcarcinomacellsstablytransfectedosidecouldsignificantlyreduceHBsAg、HBeAglevel.After48hoursofcontinuousexposuretoTubeimosideattheconc
3、entrationof0.1mg/mlinvitroculture,theinhibitionsofHBsAg，HBeAgg/mlinvitroculture.ConclusionTheantiHBVeffectofTubeimosideisdemonstratedin2．2．15cells．Keyoside；2．2．15cells；HBV；Invitro乙型肝炎是由嗜肝DNA病毒（HepatitisBvirus,HBV）引起的一種世界范圍內(nèi)的傳染性疾病。目前全世界約有3億多人為慢性HBV感染，我國(guó)約占半數(shù)。受HBV慢性感染
4、的人群罹患肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）的相對(duì)危險(xiǎn)性至少增加100倍，并最終導(dǎo)致死亡，給人們的健康造成極大的威脅和損害。因此，尋求高效低毒的抗HBV的天然藥物已成為刻不容緩的問題［1，2］。土貝母含有多種化學(xué)成分，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制等多種藥理作用［3］。陳英俊等［4］曾用土貝母加入九三三肝泰丸中治療乙型肝炎208例，總有效率為93.4%，說明土貝母在治療乙肝的復(fù)方中起到了一定的作用，但土貝母是否具有抗HBV的作用國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。為了觀察土貝母皂苷對(duì)乙型肝炎病毒是否
5、有影響，我們用HBV基因轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞系（HepG2）的2.2.15細(xì)胞體外培養(yǎng)作工具，檢測(cè)土貝母皂苷在體外對(duì)乙型肝炎病毒的作用?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。1.材料與方法1.1材料2.2.15細(xì)胞系HBV（adl，轉(zhuǎn)接種于6孔、96孔培養(yǎng)板及25ml培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)4d后換含不同濃度（10，5，1，0.1，0.01mg/ml）的土貝母皂苷培養(yǎng)液，分別作用24，48，72h。每24h換液1次，共培養(yǎng)72h，換出的上清及收集的細(xì)胞置20℃保存?zhèn)錅y(cè)。以相同條件不含藥物培養(yǎng)液和陽性對(duì)照藥物(拉米夫定)培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照?？瞻卓撞患?/p>
6、細(xì)胞，只加培養(yǎng)液。1.2.2藥物對(duì)細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)用MTT比色分析法［6］檢測(cè)細(xì)胞吸光度值，與相應(yīng)對(duì)照孔的吸光度值（存活細(xì)胞100）比較，按公式計(jì)算存活細(xì)胞的百分比，對(duì)細(xì)胞毒性進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值）×100。1.2.3藥物對(duì)2.2.15細(xì)胞HBsAg，HBeAg和HBcAg的影響細(xì)胞爬片：用間接免疫熒光法［7］進(jìn)行染色，于熒光顯微鏡下觀察，以胞膜或核膜呈黃綠色熒光者為陽性。流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）檢測(cè)：上機(jī)前細(xì)胞懸液用PBS液200ml重懸，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)出黃綠色熒光，設(shè)定氬離
7、子激發(fā)光源為488nm，用CellQuest軟件采集細(xì)胞20000個(gè)再進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以單參數(shù)直方圖表示。1.2.4藥物作用后細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg，HBeAg和HBVDNA的檢測(cè)HBsAg、HBeAg的檢測(cè)：用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA法）分別檢測(cè)每孔HBsAg，HBeAg的P/N值，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，根據(jù)公式計(jì)算抑制率：某藥對(duì)HBsAg或HBeAg的抑制率=［（對(duì)照組平均P/N藥物處理組平均P/N）/對(duì)照組平均P/N］×100［8］上清中HBVDNA的檢測(cè)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR法操作按試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果以Ct值
8、表示。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0軟件，配對(duì)t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1藥物的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)在加入不同濃度的土貝母皂苷和3TC作用24，48h及72h后，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變，72h內(nèi)土貝母皂苷1，0.1mg/ml及0.01mg/ml和3TC各組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組無明顯差別；土貝母皂苷10mg
