維生素e琥珀酸酯對mcf7乳腺癌細(xì)胞三苯氧胺敏感性的影響論文

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1、維生素E琥珀酸酯對MCF7乳腺癌細(xì)胞三苯氧胺敏感性的影響論文【摘要】目的檢測維生素E琥珀酸酯（VES）對MCF7乳腺癌細(xì)胞三苯氧胺敏感性的影響。方法人乳腺癌細(xì)胞MCF7以VES刺激24h，VES濃度為5μg/ml和10μg/ml。隨后以1μM，2.5μM，5μM和10μM的三苯氧胺作用24h，以MTT法測定對細(xì)胞增殖的抑制作用，RTPCR法檢測VES對HER2mRNA表達(dá)的影響，以免疫組化法檢測VES作用前后HER2產(chǎn)物cerbB2表達(dá)的變化。結(jié)果TAM對MCF7乳腺癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，VES處理后.freelRNA轉(zhuǎn)錄水平

2、有一定程度的下降，乳腺癌細(xì)胞cerbB2的表達(dá)降低。結(jié)論VES對MCF7乳腺癌細(xì)胞三苯氧胺的敏感性具有增強(qiáng)作用，可能與降低HER2基因表達(dá)產(chǎn)物有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】維生素E琥珀酸酯乳腺腫瘤三苯氧胺敏感性0引言乳腺癌是一種常見于婦女的激素依賴性惡性腫瘤，內(nèi)分泌治療是乳腺癌綜合治療措施中的重要一環(huán)。對于雌激素受體陽性的乳腺癌常采用內(nèi)分泌治療，三苯氧胺是最常用的一線藥物。但有報(bào)道指出，長期應(yīng)用三苯氧胺后會使乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性從而降低對內(nèi)分泌治療的反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)旨在檢測新的腫瘤凋亡誘導(dǎo)藥物VES對雌激素受體陽性的乳腺癌MCF7細(xì)胞三苯氧胺治療敏感性的

3、影響，并分析其對HER2基因表達(dá)的調(diào)控作用。1材料與方法1.1細(xì)胞和主要試劑人乳腺癌細(xì)胞株MCF7受贈于上海腫瘤醫(yī)院乳腺中心，VES和三苯氧胺購自SIGMA公司。MTT為AMRESCO產(chǎn)品，RNA抽提試劑盒為安徽優(yōu)晶公司產(chǎn)品，RTPCR一步法試劑盒為Takara公司產(chǎn)品。1.2細(xì)胞培養(yǎng)和藥物作用MCF7細(xì)胞以含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。VES和三苯氧胺以無水乙醇溶解，VES實(shí)驗(yàn)濃度為5μg/ml和10μg/ml，三苯氧胺為1μM、2.5μM、5μM和10μM。無水乙醇在培養(yǎng)基內(nèi)的終濃度2‰。V

4、ES作用24h后再以不含藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，隨后按照上述濃度加入三苯氧胺刺激24h，以MTT法檢測藥物對細(xì)胞的增殖抑制作用。1.3MTT法檢測藥物對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用乳腺癌細(xì)胞以2×104/ml接種于96孔板，每孔200μl，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。接種細(xì)胞24h后加入藥物。藥物處理結(jié)束后每孔加入5g/LMTT20μl，繼續(xù)于37℃孵箱培養(yǎng)4h后，棄上清，加入DMSO150μl/孔，震蕩5min后于自動酶標(biāo)儀上進(jìn)行比色，測定波長為492nm吸光值（A）。計(jì)算藥物對乳腺癌細(xì)胞的生長抑制率。抑制率（%）=（空白對照組平均A值-實(shí)驗(yàn)組平均A值）/空白

5、對照組平均A值×100%。1.4RTPCR法檢測VES對HER2mRNA表達(dá)的影響5μg/ml和10μg/mlVES刺激MCF7細(xì)胞24h后，按照RNA抽提試劑盒的操作步驟抽提總RNA并根據(jù)在260nm吸光值進(jìn)行定量。使用Takara一步法RTPCR試劑盒檢測HER2mRNA的表達(dá)，引物序列見表1。反應(yīng)條件為：逆轉(zhuǎn)錄65℃，30min。PCR反應(yīng)為30個(gè)循環(huán)(解鏈94℃，30s；退火63℃，60s，以及延伸72℃，60s)。反應(yīng)結(jié)束后在1%瓊脂糖凝膠分析逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)物。以未經(jīng)VES處理的MCF7細(xì)胞設(shè)為對照。表1RTPCR反應(yīng)引物序

6、列（略）1.5免疫組化法檢測cerbB2蛋白表達(dá)蓋玻片置于6孔板內(nèi)，按細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。5μg/ml和10μg/mlVES作用24h后取出玻片，丙酮固定5min。采用免疫組化鏈霉素親合素—生物素化過氧化物酶標(biāo)方法，經(jīng)微波修復(fù)抗原，按試劑盒說明書操作，檢測VES處理前后cerbB2在MCF7細(xì)胞中的表達(dá)，以未經(jīng)VES處理的MCF7細(xì)胞設(shè)為對照。細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒的為cerbB2陽性細(xì)胞。采用AB值法1。A表示顯色深淺，0為無顯色，1為淺黃色，2為棕黃色，3為棕褐色；B為每個(gè)視野染色細(xì)胞比例，1為陽性細(xì)胞1/3，2為1/3～

7、2/3，3為2/3。每例觀察5個(gè)高倍視野計(jì)算A×B值的平均值。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2結(jié)果2.1TAM對雌激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞的生長抑制作用0.2%無水乙醇對乳腺癌細(xì)胞的增殖無顯著影響(P0.05)。不同濃度的TAM對MCF7細(xì)胞具有顯著的生長抑制作用(P0.05)，表現(xiàn)為劑量-依賴關(guān)系，見表2。表2TAM對MCF-7細(xì)胞的生長抑制作用（略）*與空白對照相相比，P0.052.2VES對乳腺癌細(xì)胞的三苯氧胺敏感性的影響MCF7細(xì)胞經(jīng)VES預(yù)處理24h后，對三苯氧胺的敏感性增強(qiáng)，表現(xiàn)為相同濃度和作

8、用時(shí)間的三苯氧胺對MCF7細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)(P0.05),見圖1。1.TAM1μM;2.TAM2.5μM;3.TAM5μM;4.