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《金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗特異表達基因》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、金龜子綠僵菌侵染東亞飛蝗特異表達基因篩選與體內(nèi)定殖階段cDNA文庫構(gòu)建本研究由國家自然科學(xué)基金資助項目編號：No:30771446重慶大學(xué)博士學(xué)位論文學(xué)生姓名：指導(dǎo)教師：玉先教授專業(yè)：生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)科門類：工學(xué)重慶大學(xué)生物工程學(xué)院二OO九年四月IdentificationofGenesDifferentiallyExpressedbyMetarhiziumanisopliaeInfectLocustamigratoriaandConstructionofcDNALibraryfromMetarhiziumanisopliaeintheHemolymphofLocustamigra
2、toriaTheresearchwassupportedbygrantfromtheNaturalScienceFoundationofChina.No:30771446AThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofDoctorofEngineeringBySupervisedbyyYYyProf.導(dǎo)師***Major:BiomedicalEngineeringCollegeofBioengineeringOFChongqingUniversity,Ch
3、ongqing,ChinaApril,2009中文摘要摘要金龜子綠僵菌（Metarhiziumanisopliae）是一類重要的昆蟲病原真菌，在害蟲生物防治中起著重要作用。與化學(xué)農(nóng)藥相比，昆蟲病原真菌開發(fā)的真菌殺蟲劑作用時間持久、無環(huán)境污染、對非靶標(biāo)生物安全，但存在致死時間長，殺蟲效率低，防效不穩(wěn)定等缺點，嚴重阻礙了真菌殺蟲劑的廣泛應(yīng)用，為解決這一問題，在分子水平上揭示昆蟲病原真菌致病機理尤為重要。金龜子綠僵菌侵染寄主昆蟲時，分生孢子在體表萌發(fā)形成附著胞，并分泌多種蛋白酶類降解昆蟲體壁，附著胞的形成與分化在侵染過程中發(fā)揮著重要作用。金龜子綠僵菌直接穿透寄主體壁進入體內(nèi)，在血淋巴定
4、殖，以掠奪寄主營養(yǎng)或分泌毒素使寄主死亡，能否在體內(nèi)成功定殖決定著侵染的最終結(jié)果。篩選附著孢形成時期和血淋巴定殖階段的特異表達基因和基因表達分析對于研究昆蟲病原真菌致病機理具有重要意義。EST序列分析和微陣列技術(shù)是研究昆蟲病原真菌致病機理的成功策略，國內(nèi)外許多研究者通過這種策略對綠僵菌侵染昆蟲致病機理進行了深入研究，但采用的方法均是離體條件下，在各種液體培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物培養(yǎng)，然后構(gòu)建綠僵菌cDNA文庫，大規(guī)模測序，進行EST序列分析。很明顯，這些技術(shù)路線有一定的局限性，綠僵菌在離體液體培養(yǎng)環(huán)境下處于腐生生長階段，而綠僵菌侵染昆蟲過程處于寄生生活階段，離體條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)和事實的侵染
5、過程差別明顯，很難對綠僵菌穿透寄主體壁機制，定殖寄主血淋巴適應(yīng)機制作出完整的詮釋，從而闡明病原真菌和寄主的相互作用關(guān)系。本研究以金龜子綠僵菌（Metarhiziumanisopliae）菌株CQMa102和東亞飛蝗（Locustamigratoria）為研究對象，從寄主血淋巴中分離出無寄主核酸污染的綠僵菌菌體，以已降解寄主核酸的東亞飛蝗翅膀誘導(dǎo)附著孢形成與分化，利用抑制消減雜交技術(shù)（SSH）篩選綠僵菌在附著胞形成時期和定殖血淋巴階段的差異表達基因。DSN均一化和SMART技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了金龜子綠僵菌CQMa102定殖東亞飛蝗血淋巴階段的全長均一化cDNA文庫，大規(guī)模測序，進行ES
6、T序列分析，分析綠僵菌定殖寄主血淋巴階段的基因表達特征，以闡明寄主和病原物之間的相互作用關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：1．觀察了金龜子綠僵菌CQMa102在實驗條件下侵染東亞飛蝗的致病過程：發(fā)現(xiàn)24h左右分生孢子穿透寄主表皮進入血淋巴，接觸血細胞，引起血細胞聚集；3天～6天大量的芽生孢子被血細胞吞噬、包囊；在寄主昆蟲死亡前24h左右，血細胞數(shù)量急劇減少，芽生孢子開始迅速繁殖，血淋巴內(nèi)懸浮著大量酵母狀蟲菌體101中文摘要（hyphalbody）。2．根據(jù)寄主血細胞和病原真菌細胞結(jié)構(gòu)差別，建立和完善了利用蛋白酶K和SDS迅速裂解寄主血細胞的方法，整個流程時間約40min，RT-PCR檢測表
7、明，利用寄主血細胞裂解釋放的內(nèi)源RNases和PBS洗滌可高效去除蟲菌體中的寄主核酸污染，這一結(jié)論也被后續(xù)EST序列分析所證明。3.以寄主體內(nèi)分離，去除寄主核酸污染的綠僵菌菌體提取mRNA為實驗組（tester），使用RNAfragmentationbuffer處理東亞飛蝗翅膀，降解寄主核酸，并誘導(dǎo)附著孢形成與分化，以該時期的菌體提取mRNA為驅(qū)動組（driver），進行抑制消減雜交（suppressionsubtractivehybridization,SSH），篩選出350個
