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《異種vegf融合蛋白疫苗對(duì)小鼠lewis肺癌的抑制作用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、異種VEGF融合蛋白疫苗對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑制作用作者：劉倩,唐亮,李英輝,周彩存,談立松,趙玉軍,張培德,張尚權(quán)【摘要】 目的:利用原核表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建異源血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子融合蛋白疫苗,研究該融合蛋白疫苗對(duì)小鼠Lewis肺癌腫瘤模型的抗血管生成主動(dòng)免疫治療效果。方法:將雞VEGF基因克隆入pGEX-4T-2原核表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),Ni-NTA純化,透析復(fù)性,構(gòu)建GST-cVEGF融合蛋白疫苗。將C57BL16J小鼠隨機(jī)分為3組,GST-cVEGF疫苗組10只、cVEGF疫苗組10只、生理鹽水組(NS)10只
2、。將各組樣品與等體積弗氏佐劑混合,各組小鼠每只分別0、2、3周免疫100μgGST-cVEGF融合蛋白疫苗、單純cVEGF蛋白疫苗、生理鹽水。接種Lewis肺癌細(xì)胞,觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況和小鼠狀態(tài)。接種腫瘤18d后,處死小鼠,剝離腫瘤稱重。檢測(cè)小鼠血清中特異性抗VEGF抗體滴度。結(jié)果:GST-cVEGF疫苗組、cVEGF組、生理鹽水組腫瘤均重分別為(1.55±0.534)g、(1.93±0.607)g、(2.87±0.642)g。GST-cVEGF疫苗組腫瘤重量明顯小于生理鹽水組(P<0.01)。疫苗組血清產(chǎn)生抗VEGF抗體滴
3、度為1∶2000。結(jié)論:異種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因重組融合蛋白疫苗可干擾機(jī)體對(duì)自身VEGF的免疫耐受,可產(chǎn)生較高水平的特異性抗VEGF抗體,并具有抑制小鼠Lewis腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)。12【關(guān)鍵詞】血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子融合蛋白疫苗腫瘤/免疫治療小鼠 腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及其預(yù)后依賴于血管生成。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothdialgrowthfactor,VEGF)是迄今發(fā)現(xiàn)最重要的血管生成因子之一［1］。近年來(lái)以VEGF及其受體(vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)作為
4、靶分子的抗腫瘤新藥研發(fā)取得了很大的進(jìn)展,已經(jīng)有數(shù)個(gè)藥物經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。重組人源化的鼠單克隆抗體（mAb）Avastin［2］,可有效地抑制多種人類腫瘤細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng),高親合力地結(jié)合VEGF,可直接阻斷VEGF通過(guò)VEGFR的信號(hào)表達(dá)。本研究中,我們構(gòu)建了谷光甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）與雞源VEGF(cVEGF)融合基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒,在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá),并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化及復(fù)性,再進(jìn)一步研究該融合蛋白疫苗對(duì)小鼠Lewis肺癌腫瘤模型的抗血管生成主動(dòng)免疫治療效果?！ ?材料和方法 1.1材料質(zhì)粒抽提試劑盒
5、、膠回收試劑盒、各種限制性核酸內(nèi)切酶、ExTaq酶、T4DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司;弗氏完全佐劑,不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司;12重組人VEGF165抗原購(gòu)自美國(guó)PeproTechEC公司;山羊抗小鼠IgG-HRP購(gòu)自SantaCruz公司;96孔酶標(biāo)板NUNC公司產(chǎn)品;次氮基三乙酸鎳瓊脂糖(Ni-NTA)和蛋白質(zhì)分離純化柱購(gòu)自Qiagen公司;小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存;4周齡C57BL/6J小鼠（♀）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞研究所?！ ?.2方法 1.2.1VEGF基因克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建為了利于
6、表位之間以及表位與蛋白之間的融合,在GST的基因序列與cVEGF基因序列之間引入6個(gè)Gly的柔性接頭序列,并在下游引入HIS-Tag基因序列以便于對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,設(shè)計(jì)帶EcoRI-XhoI酶切位點(diǎn)的引物PrimerI(由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成):上游:5′-GCGAATTCCGGGCGGTGGCGGTGGCGGTAACTTTCTGCTCACTTGGATC-3′。下游:5′-GC-CTCGAGCTCAGTGATGGTGATGGTGATGCCGTCTCGGTTTTTCACA-3′。以pMD18-T-cVEGF質(zhì)粒（本實(shí)
7、驗(yàn)室保存）為模板,PCR擴(kuò)增,條件為:94℃變性4min;94℃30s,58℃30s,72℃1min,共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切回收連接至pGEX-4T-2原核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株。PCR和雙酶切鑒定,并進(jìn)行測(cè)序鑒定(捷瑞生物工程(上海)有限公司測(cè)部)?！ ?.2.2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化挑取陽(yáng)性菌株,在終濃度為0.8mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。分別收取誘導(dǎo)前后標(biāo)本,12超聲破菌,作聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)菌體,將所得包涵體經(jīng)洗滌液
8、（含5g/LTritonX-100,10mmol/LEDTA,pH8.0)反復(fù)洗滌3次,再分別用2mol/L,4mol/L尿素洗滌3次,變性溶解在含10mmol/L巰基乙醇的8mol/L尿素中,按Qiagen公司方法,采用Ni-NTA親和層析柱分離
