熒光偏振常用熒光標(biāo)記物

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1、目前常用于標(biāo)記抗體的熒光素有以下幾種。異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長為490～495nm，最大發(fā)射光波長為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。480/535：5-氨基熒光素AF，EDF和HDF四乙基羅丹明(rhodamine,RB20

2、0)RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595～600nm，呈現(xiàn)橘紅色熒光。四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC)TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｒ蚱錈晒獯銣缏?，也可用于單?dú)標(biāo)記染色。酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如，4-甲基傘酮

3、-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性磷酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。5．鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪(Eu3+)、鋱(Tb3+)等的螯合物可發(fā)射特征性的熒光，而且激發(fā)光波長范圍寬、發(fā)射光波長范圍窄、熒光衰變時(shí)間長，最適合于時(shí)間分辨熒光免疫測定。鑭系鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3應(yīng)用最廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時(shí)間長

4、，最適合用于分辨熒光免疫測定。藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進(jìn)行光合作用的自然熒光色素，分子量為240kD的蛋白，最大吸收峰為564nm，當(dāng)使用488nm激光激發(fā)時(shí)其發(fā)射熒光峰值約為576nm，對于單激光器的流式細(xì)胞儀來說，推薦使用585±21nm的帶通濾光片，雙激光器的流式細(xì)胞儀推薦使用575±13nm的帶通濾光片。FL2探測器檢測PE。多甲藻葉綠素蛋白（PerCP）PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學(xué)合成器中發(fā)現(xiàn)的，是一種蛋白復(fù)合物，分子量約為35kD，最大激發(fā)波長的峰值在490nm附近，當(dāng)被488nm氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光的峰值

5、約為677nm。FL3探測器檢測PerCP。碘化丙啶（propidiumiodide，PI）可選擇性地嵌入核酸（DNA、RNA）的雙螺旋堿基對中。在對DNA染色時(shí)，需用RNase對細(xì)胞進(jìn)行處理，以排除RNA對DNA熒光定量精度的影響。在488nm波長激發(fā)下，PI的發(fā)射光譜為610-620nm。FL2探測器檢測PI。中間體異硫氰酸熒光素乙二胺（fluoresceinthiocarbamylethylenediamine，EDF）和異硫氰酸熒光素己二胺（fluoresceinthiocarbamylhexylenediamine，HDF）合成：用甲醇配制1%的三乙胺溶液，分別將20

6、mg（0.3mmol）乙二胺和34.8mg（0.3mmol）己二胺溶于5ml甲醇三乙胺溶液中；再將11.7mg（0.03mmol）FITC溶于1ml甲醇三乙胺溶液中，逐滴加到乙二胺和己二胺溶液中，室溫避光攪拌反應(yīng)1h，濃縮，硅膠柱層析（乙酸乙酯﹕甲醇＝3﹕1，v﹕v），得到粉末狀的EDF和HDF，電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）鑒定后，備用。名稱吸收波長發(fā)射波長標(biāo)記何基團(tuán)FITC490～495nm520～530nm－ＮＨ２，－ＯＨ，－ＳＨ羥基熒光素（ＦＡＭ）492518－ＮＨ２，－ＯＨ，－ＳＨ四氯熒光素（ＴＥＴ）521538－ＮＨ２，－ＯＨ，－ＳＨ六氯熒光素，Hexachlor

7、ofluorescein535556－ＮＨ２，－ＯＨ，－ＳＨ四乙基羅丹明（ＲＢ２００）570nm595～600nm－ＮＨ2四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm－ＮＨ2羧基四甲基羅丹明（ＴＡＭＲＡ）560582－ＮＨ25-氨基熒光素（AF）二苯乙烯、萘酰亞胺、香豆素類、吖啶類、芘類等都可用于蛋白質(zhì)標(biāo)記。近年來，菁染料逐漸受到人們的關(guān)注。目前研究比較活躍的標(biāo)記菁染料主要有兩大類，一類是噻唑橙（ｔｈｉａｚｏｌｅｏｒａｎｇｅ，ＴＯ）、唑橙（ｏｘａｚｏｌｅｏｒａｎｇｅ，ＹＯ）系列及