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《大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng)與鑒定.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng)與鑒定【摘要】目的探討新生2dSpragueDawley(SD)大鼠腦少突膠質(zhì)細(xì)胞的分離方法和生長條件，為少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷后髓鞘形成障礙或脫髓鞘疾病的研究奠定基礎(chǔ)。方法根據(jù)星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的生長時間差異、細(xì)胞生長方式及細(xì)胞對培養(yǎng)層粘附等特性的不同，采用兩次恒溫?fù)u床振蕩分離純化法和條件限定培養(yǎng)基培養(yǎng)獲取并鑒定高純度的大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果培養(yǎng)出突起有如蜘蛛網(wǎng)狀的成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞，半乳糖腦苷脂陽性。結(jié)論兩次恒溫?fù)u床振蕩分離純化法和條件限定培養(yǎng)基培養(yǎng)可獲取高純度的大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞?！娟P(guān)鍵詞】少突膠質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；純化；鑒定Abstract：
2、0bjectiveToculture,purifyandidentifytheastrocytesandoligodendrocytesfromratcerebraltissue.MethodsBasedonthedifferentpropertiesofdevelopmentaltimecoursescellularadhesionsandgrowthpatternofastroglialcellsandoligodendrocytesoligodendrocyteswereculturedandpurifiedbyorbitalshakingfortwiceandth
3、edefinedculturemediumandidentifiedbyimmmunofluorescentstaining.ResultsTheripeoligodendrocyteswereculturelactocerebroside.Cweusedwassuitableanoligodendrocytes.Keywords：oligodendandidentifiedbygaonelusionThemethodndeffectivetoobtaidrocyte；cultivation；purification；identification少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)
4、的髓鞘形成細(xì)胞，它起源于胚胎神經(jīng)管的神經(jīng)上皮細(xì)胞，隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，逐步遷移到白質(zhì)，并增殖、分化，形成髓鞘包裹軸突。少突膠質(zhì)細(xì)胞在發(fā)育過程中，大體經(jīng)歷了少突膠質(zhì)細(xì)胞/II型星形膠質(zhì)前體細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞/II型星形膠質(zhì)袓細(xì)胞、未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞幾個階段［1］，其形態(tài)、表迗產(chǎn)物和功能呈現(xiàn)一個漸變及連續(xù)的過程，并沒有嚴(yán)格的界限。在髓鞘形成障礙等疾病研究中，發(fā)現(xiàn)脫髓鞘或再生的軸突能否再髓鞘化是影響神經(jīng)功能恢復(fù)的重要原因之一。近年來應(yīng)用細(xì)胞替代治療已成為一大熱點［23］，通過體外培養(yǎng)獲得少突膠質(zhì)細(xì)胞，將其移植入髓鞘形成障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，可揭示髓鞘形成和
5、再生機(jī)制［4］。這些實驗需要大量的少突膠質(zhì)細(xì)胞，因此必須對少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外純化和培養(yǎng)。本研究依據(jù)星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的生長時間、細(xì)胞生長方式及細(xì)胞對培養(yǎng)層粘附等特性的不同，采用兩次恒溫?fù)u床振蕩分離純化法和條件限定培養(yǎng)基培養(yǎng)，以探討少突膠質(zhì)細(xì)胞的分離方法和生長條件。1材料與方法材料實驗動物為新生48h之內(nèi)普通級SpragueDawley(SD)大鼠，由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。主要試劑及其配制：①細(xì)胞培養(yǎng)的基本試劑。新生胎牛血清、高糖DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基、PBS,TritonX100、多聚賴氨酸、亞硒酸納、腐胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白，PDGFAA、bFGF,胰
6、島素、甲狀腺素均為醫(yī)用試劑。DMEM/F12(1:1)條件培養(yǎng)基A配方為DMEM/F12、10ng/mLPDGF、1Ong/mLbFGF,%FCSoDMEM/F12(1:1)條件培養(yǎng)基B配方［5］為DMEM/F12、亞硒酸鈉ug/mL、腐胺mg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白5Omg/L、胰島素5mg/L、甲狀腺素Pg/L、碳酸氫鈉g/Lo②免疫熒光的主要試劑。小鼠抗大鼠A2B5單克隆抗體(R&D)、兔抗大鼠Gal多克隆抗體、山羊抗小鼠IgM抗體TRITC、山羊抗兔IgGFITCo方法大鼠皮層膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)取出生48h之內(nèi)的SD大鼠，無菌條件下取大腦，置入PBS液中，在解剖顯微鏡下剔除腦
7、膜及血管，分離出大腦皮層。剪碎后，反復(fù)機(jī)械輕輕吹打，100目濾器過濾，1500r/min離心5min，棄上清。加入培養(yǎng)基高糖DMEM，含15%FCS，使細(xì)胞充分分離，然后以1X106的密度接種于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中，3d換液一次。純化及少突膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)細(xì)胞生長7?8d后可分為兩層，用封口膜封閉培養(yǎng)瓶口，置于37°C恒溫?fù)u床中，150r/min振蕩2h后，吸掉上層培養(yǎng)液，去除小膠質(zhì)細(xì)胞，加入培養(yǎng)基高糖DMEM，含15%FCS,再以250r/min振蕩17?19h,收集脫落細(xì)胞于離
