納豆激酶論文：納豆激酶優(yōu)化、提取分離純化及基因克隆

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1、納豆激酶論文：納豆激酶的優(yōu)化、提取分離純化及基因克隆【中文摘要】心腦血管性疾病,具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、并發(fā)癥多”納豆激酶論文：納豆激酶的優(yōu)化、提取分離純化及基因克隆【中文摘要】心腦血管性疾病,具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、并發(fā)癥多”等特性。2005年,世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查表明,全世界每年約有1700萬(wàn)人死于心腦血管疾病。并且隨著人類生活水平的提高以及生活壓力的增加,而呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì),而血栓又是心腦血管疾病中致死率最高的疾病。所以,血栓的防治已是當(dāng)務(wù)之急。雖然傳統(tǒng)藥物在心腦血管及血栓栓塞性疾病防治上療效顯著,但毒副作用嚴(yán)重;而傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品不僅效果顯著且安全無(wú)毒,可

2、作為一種具有開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值的功能性預(yù)防保健食品。據(jù)文獻(xiàn)記載,納豆源于中國(guó)的豆豉,通過(guò)佛教由中國(guó)傳入日本,日本人均壽命長(zhǎng)的原因除了與較為優(yōu)良的自然環(huán)境有關(guān)外,更重要的是其膳食結(jié)構(gòu)中,發(fā)酵食品特別是消費(fèi)量最大的納豆,是日本人長(zhǎng)壽的秘方,視為國(guó)寶級(jí)食品。寺院喜食大豆是因?yàn)槠涞鞍踪|(zhì)含量高達(dá)35.3%,而由納豆菌產(chǎn)出的酶,能使50%的蛋白質(zhì)變?yōu)樗苄?消化率可達(dá)80%。還含氨基酸、維生素、植物性脂肪等。據(jù)科學(xué)研究表明,納豆食品不僅調(diào)整胃腸功能明顯,還具有治療感冒、痢疾、脹氣、胃腸炎、消化不良、殘便、便秘等功效,還有防治糖尿病,抑制血栓的生成和溶解血栓的作用,是一種延年益壽、健康的美容食品?？梢哉f(shuō)納豆是一

3、種自然食品,是人類生活智慧的產(chǎn)物。1987年日本的Sumi博士首次從日本傳統(tǒng)食品納豆中分離出一種具有強(qiáng)烈纖溶作用的堿性蛋白酶并命名納豆激酶(nattokinase,NK)。它不但能直接作用交聯(lián)纖維蛋白,而且還可激活體內(nèi)的纖溶酶原,從而表現(xiàn)出很強(qiáng)的溶血栓作用。據(jù)報(bào)道其制品具有水解淀粉樣蛋白,降低血漿纖維蛋白原的第七因子和第八因子,降低血液粘度、降血脂、降膽固醇,降血壓,改善血液循環(huán)狀態(tài),維持血細(xì)胞的正常形態(tài)和功能,有利于神經(jīng)損傷的再生,抑制骨質(zhì)疏松癥、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等多種功能。由于NK具有安全性好、成本低、經(jīng)口服后可迅速入血,作用時(shí)間長(zhǎng),胃腸道穩(wěn)定性好,可由細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)、也可由基因工程菌生產(chǎn)等

4、優(yōu)點(diǎn),有望被開(kāi)發(fā)為新一代的口服抗血栓藥物用于血栓性疾病的預(yù)防和治療。但是直到現(xiàn)在,納豆激酶的來(lái)源主要是發(fā)酵的日本納豆,因其獨(dú)特的風(fēng)味很多人不能接受。雖然含有納豆激酶作為主要成分的膠囊制劑已在日本,韓國(guó),朝鮮生產(chǎn),但由于只能短期供應(yīng)和高昂的代價(jià),其應(yīng)用很有限。為了使其既方便又廣泛使用,人們從分子生物學(xué)角度尋找更好的表達(dá)載體和宿主菌,優(yōu)化表達(dá)條件等方面做了進(jìn)一步的研究,應(yīng)用基因工程制品純化出更為優(yōu)質(zhì)的溶栓藥物,將具有更為廣泛的應(yīng)用前景,給臨床帶來(lái)新的曙光。本研究通過(guò)發(fā)酵液優(yōu)化、鹽析、層析、蛋白含量、纖溶活力測(cè)定、SDS-PAGE等技術(shù)和手段,通過(guò)傳統(tǒng)方法提取分離純化納豆激酶,檢測(cè)其活性。還通過(guò)分子

5、生物學(xué)技術(shù),提取納豆枯草芽孢桿菌基因組DNA,設(shè)計(jì)引物,PCR克隆納豆激酶及納豆激酶原。選擇合適的表達(dá)表達(dá)載體和宿主菌,以期應(yīng)用基因工程制品純化出更為安全優(yōu)質(zhì)溶栓藥物,為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法1.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比濁法連續(xù)測(cè)定OD600值,繪制菌種生長(zhǎng)曲線,確定納豆菌培養(yǎng)條件,以便更好地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。為了進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量,降低發(fā)酵成本,我們采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。2.將粗酶液經(jīng)離心,40~45%鹽析,CM-Cellulose離子交換層析和SephadexG-100凝膠柱可以提取出單一酶,并用SDS-PAGE測(cè)定分子量,比較粗酶液與提取出的單一酶液的酶活力。3.納豆枯草芽孢

6、桿菌基因組DNA提取后,經(jīng)PCR擴(kuò)增納豆激酶及納豆激酶原序列,并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。為進(jìn)一步構(gòu)建重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌做鋪墊,后續(xù)工作有待進(jìn)一步研究。結(jié)果1.培養(yǎng)基成分的最優(yōu)組合為MgSO40.02%、K2HPO40.02%、KH2PO40.01%、CaCl20.05%、麥芽糖3%、大豆蛋白胨3%、最適培養(yǎng)溫度37℃、最適pH為8.0、最佳接種量為每5g黃豆接種500μL。優(yōu)化發(fā)酵條件后生產(chǎn)的納豆激酶,酶活由優(yōu)化前的31.25IU/mL發(fā)酵液提高到158.74IU/mL發(fā)酵液,單位產(chǎn)量提高了約5.08倍。2.經(jīng)CM-Cellulose離子交換層析分離納豆激酶酶,得到0.10mol/LN

7、aCl洗脫峰中含有活性組份,Folin-酚法測(cè)酶活為168.56IU/m。將0.10mol/LNaCl洗脫峰中的納豆激酶酶用SephadexG-100凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行分離,Folin-酚法測(cè)酶活為137.16IU/mL,并用SDS-PAGE測(cè)定它們的分子質(zhì)量為28000Da。3.納豆枯草芽孢桿菌基因組DNA提取后,經(jīng)PCR擴(kuò)增納豆激酶(275個(gè)氨基酸,堿基825bp)及納豆激酶原序列(381個(gè)氨基