缺血后處理對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織細(xì)胞凋亡及

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1、缺血后處理對(duì)腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織細(xì)胞凋亡及【摘要】目的：觀察缺血后處理(IPo)對(duì)大鼠腎缺血再灌注(I/R)損傷后腎組織細(xì)胞凋亡及bcl2和bax基因表達(dá)的影響，并探討其腎保護(hù)的機(jī)制.方法：18只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組（S組），缺血再灌注組（I/R組），缺血后處理組（IPo組）,每組6只.采用夾閉雙側(cè)腎蒂45min,再灌注6h制備腎臟缺血再灌注模型.IPo組在夾閉雙側(cè)腎蒂45min后，再灌注10s，缺血10s，反復(fù)3次，再全面恢復(fù)血液灌注.再灌注6h時(shí)處死大鼠，酶法測(cè)定血清肌酐（Cr）含量;苦味酸不除蛋白法測(cè)定尿素氮（BUN）含量;采用逆轉(zhuǎn)錄－多聚酶鏈反應(yīng)（RT

2、PCR）檢測(cè)腎組織bcl2mRNA和baxmRNA表達(dá)，表達(dá)水平以與其相應(yīng)的內(nèi)參βactin的光密度比表示；原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)腎組織中凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）；蘇木素伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化.結(jié)果：與S組比較，I/R組腎組織Cr和BUN濃度升高（P<0.05），bcl2mRNA表達(dá)量降低（P<0.05），baxmRNA表達(dá)量升高（P<0.05），bcl2mRNA/baxmRNA的比值降低（P<0.05），AI增加（P<0.05），組織形態(tài)學(xué)觀察可見腎小管上皮細(xì)胞水腫，變性壞死，腎小管

3、擴(kuò)張，間質(zhì)淤血、水腫、大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn).與I/R組相比，IPo組腎組織Cr和BUN濃度降低（P<0.05），bcl2mRNA表達(dá)量升高（P<0.05），baxmRNA表達(dá)量降低（P<0.05），bcl2mRNA/baxmRNA的比值升高（P<0.05），AI減少（P<0.05），腎組織形態(tài)學(xué)損傷減輕.結(jié)論：缺血后處理可減輕腎臟I/R損傷，其腎保護(hù)作用可能與其上調(diào)bcl2基因和下調(diào)bax基因表達(dá)，使bcl2mRNA/baxmRNA比值升高，從而抑制缺血再灌注損傷后的腎組織細(xì)胞凋亡有關(guān).【關(guān)鍵詞】腎再灌注損傷細(xì)胞凋亡基因bcl2缺血后處理0引言缺

4、血后處理（ischemicpostconditioning，IPo）可減輕心肌缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)損傷［1-2］，還可減輕腦［3］、肝［4］及腸的I/R損傷.本課題的前期研究發(fā)現(xiàn)IPo可以抑制腎I/R損傷誘發(fā)的腎組織細(xì)胞凋亡，具有一定的腎保護(hù)作用，但是抑制凋亡的的具體機(jī)制有待探討.細(xì)胞凋亡是基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，目前認(rèn)為至少有兩類基因與凋亡調(diào)控有關(guān)，以bcl2為代表的抗凋亡基因和以bax為代表的促凋亡基因共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡.本研究觀察了IPo對(duì)大鼠腎I/R損傷后腎組織細(xì)胞凋亡及bcl2和bax基因表達(dá)的影響，并探討IPo的腎保護(hù)機(jī)制.

5、1材料和方法1.1材料健康雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量250～280g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（S組），缺血再灌注組（I/R組），缺血后處理組（IPo組），每組6只.術(shù)前禁食12h，自由飲水.大鼠腹腔注射100g/L水合氯醛300mg/kg麻醉后，將大鼠仰臥位四肢固定于鼠臺(tái)上，行腹正中切口，鈍性分離腎包膜，顯露和游離腎臟，仔細(xì)分離腎蒂，保護(hù)輸尿管，用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂，腎臟顏色變?yōu)榘导t色即可確認(rèn)腎臟血流阻斷，造成雙側(cè)腎缺血45min后，顯露腎臟，松開動(dòng)脈夾,腎臟由暗紅色恢復(fù)鮮紅色即可確認(rèn)血流恢復(fù)，逐層縫合腹部正中切口.再灌注6h即為腎缺血再灌注模型.夾閉

6、和放開腎蒂時(shí)腹腔內(nèi)各注射林格液20mL/kg.S組僅行開腹，游離出雙側(cè)腎臟，分離雙側(cè)腎蒂不夾閉，傷口用生理鹽水紗布覆蓋，暴露45min不作腎缺血處理；IPo組夾閉雙側(cè)腎蒂45min后，再灌注10s，缺血10s，反復(fù)3次，再全面恢復(fù)血液灌注6h.1.2方法1.2.1標(biāo)本制備再灌注后6h,過(guò)量麻醉劑下經(jīng)心臟抽血迅速處死動(dòng)物.將血液標(biāo)本注入離心管，靜置30min，2500r/min離心15min,提取血清標(biāo)本，-70℃冰箱保存待測(cè).在無(wú)菌條件下，迅速摘取左腎，分裝入1.5mL離心管，液氮凍存，用于進(jìn)行PTPCR.取右腎，40g/L多聚甲醛固定，制備石蠟切片，4℃保存待用.1.2.2血清C

7、r,BUN含量的測(cè)定應(yīng)用SelectraE全自動(dòng)生化分析儀（Vital，荷蘭）酶法測(cè)定血清Cr水平，苦味酸不除蛋白法測(cè)定BUN含量.1.2.3腎組織bcl2mRNA和baxmRNA表達(dá)的測(cè)定取50～100mg標(biāo)本勻漿后，Trizol試劑提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)法測(cè)定RNA含量，取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以βactin為內(nèi)參照，擴(kuò)增bcl2,bax和βactin，所有引物均由上海生物工程公司合成.引物序