缺血后處理對腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織細胞凋亡及

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1、缺血后處理對腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織細胞凋亡及【摘要】目的：觀察缺血后處理(IPo)對大鼠腎缺血再灌注(I/R)損傷后腎組織細胞凋亡及bcl2和bax基因表達的影響，并探討其腎保護的機制.方法：18只雄性SD大鼠隨機分為3組:假手術組（S組），缺血再灌注組（I/R組），缺血后處理組（IPo組）,每組6只.采用夾閉雙側腎蒂45min,再灌注6h制備腎臟缺血再灌注模型.IPo組在夾閉雙側腎蒂45min后，再灌注10s，缺血10s，反復3次，再全面恢復血液灌注.再灌注6h時處死大鼠，酶法測定血清肌酐（Cr）含量;苦味酸不除蛋白法測定尿素氮（BUN）含量;采用逆轉錄－多聚酶鏈反應（RT

2、PCR）檢測腎組織bcl2mRNA和baxmRNA表達，表達水平以與其相應的內參βactin的光密度比表示；原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記（TUNEL）法檢測腎組織中凋亡細胞，計算細胞凋亡指數（AI）；蘇木素伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察腎組織病理學變化.結果：與S組比較，I/R組腎組織Cr和BUN濃度升高（P<0.05），bcl2mRNA表達量降低（P<0.05），baxmRNA表達量升高（P<0.05），bcl2mRNA/baxmRNA的比值降低（P<0.05），AI增加（P<0.05），組織形態(tài)學觀察可見腎小管上皮細胞水腫，變性壞死，腎小管

3、擴張，間質淤血、水腫、大量中性粒細胞浸潤.與I/R組相比，IPo組腎組織Cr和BUN濃度降低（P<0.05），bcl2mRNA表達量升高（P<0.05），baxmRNA表達量降低（P<0.05），bcl2mRNA/baxmRNA的比值升高（P<0.05），AI減少（P<0.05），腎組織形態(tài)學損傷減輕.結論：缺血后處理可減輕腎臟I/R損傷，其腎保護作用可能與其上調bcl2基因和下調bax基因表達，使bcl2mRNA/baxmRNA比值升高，從而抑制缺血再灌注損傷后的腎組織細胞凋亡有關.【關鍵詞】腎再灌注損傷細胞凋亡基因bcl2缺血后處理0引言缺

4、血后處理（ischemicpostconditioning，IPo）可減輕心肌缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)損傷［1-2］，還可減輕腦［3］、肝［4］及腸的I/R損傷.本課題的前期研究發(fā)現IPo可以抑制腎I/R損傷誘發(fā)的腎組織細胞凋亡，具有一定的腎保護作用，但是抑制凋亡的的具體機制有待探討.細胞凋亡是基因控制的細胞主動死亡過程，目前認為至少有兩類基因與凋亡調控有關，以bcl2為代表的抗凋亡基因和以bax為代表的促凋亡基因共同調節(jié)細胞凋亡.本研究觀察了IPo對大鼠腎I/R損傷后腎組織細胞凋亡及bcl2和bax基因表達的影響，并探討IPo的腎保護機制.

5、1材料和方法1.1材料健康雄性SD大鼠18只，體質量250～280g，由河北省實驗動物中心提供，隨機分為3組：假手術組（S組），缺血再灌注組（I/R組），缺血后處理組（IPo組），每組6只.術前禁食12h，自由飲水.大鼠腹腔注射100g/L水合氯醛300mg/kg麻醉后，將大鼠仰臥位四肢固定于鼠臺上，行腹正中切口，鈍性分離腎包膜，顯露和游離腎臟，仔細分離腎蒂，保護輸尿管，用無損傷動脈夾夾閉雙側腎蒂，腎臟顏色變?yōu)榘导t色即可確認腎臟血流阻斷，造成雙側腎缺血45min后，顯露腎臟，松開動脈夾,腎臟由暗紅色恢復鮮紅色即可確認血流恢復，逐層縫合腹部正中切口.再灌注6h即為腎缺血再灌注模型.夾閉

6、和放開腎蒂時腹腔內各注射林格液20mL/kg.S組僅行開腹，游離出雙側腎臟，分離雙側腎蒂不夾閉，傷口用生理鹽水紗布覆蓋，暴露45min不作腎缺血處理；IPo組夾閉雙側腎蒂45min后，再灌注10s，缺血10s，反復3次，再全面恢復血液灌注6h.1.2方法1.2.1標本制備再灌注后6h,過量麻醉劑下經心臟抽血迅速處死動物.將血液標本注入離心管，靜置30min，2500r/min離心15min,提取血清標本，-70℃冰箱保存待測.在無菌條件下，迅速摘取左腎，分裝入1.5mL離心管，液氮凍存，用于進行PTPCR.取右腎，40g/L多聚甲醛固定，制備石蠟切片，4℃保存待用.1.2.2血清C

7、r,BUN含量的測定應用SelectraE全自動生化分析儀（Vital，荷蘭）酶法測定血清Cr水平，苦味酸不除蛋白法測定BUN含量.1.2.3腎組織bcl2mRNA和baxmRNA表達的測定取50～100mg標本勻漿后，Trizol試劑提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，紫外分光光度計檢測法測定RNA含量，取等量RNA逆轉錄合成cDNA，以βactin為內參照，擴增bcl2,bax和βactin，所有引物均由上海生物工程公司合成.引物序