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《opa-fmoc柱前衍生高效液相色譜法測定細胞培》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、OPA/FMOC柱前衍生高效液相色譜法測定細胞培【摘要】目的:該實驗建立了以OPA/FMOC作為柱前衍生化試劑,采用高效液相色譜法測定細胞培養(yǎng)基中氨基酸含量的方法。在10~180μg.mL-1范圍內(nèi)線性關系良好,相關系數(shù)在0.9953~1.000之間,平均回收率95.9%~102.4%,CV%<3.8%(n=5),重復性RSD為0.08%~3.82%(n=6)。結論:該方法準確、靈敏、簡便快速,適用于細胞培養(yǎng)基中氨基酸的含量測定。【關鍵詞】OPA/FMOC柱前衍生法;細胞培養(yǎng)基M199;氨基酸;高效液相色譜細胞培養(yǎng)基作為細胞工程重要的原材料,其質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到生物
2、制品的產(chǎn)量,是生物制品企業(yè)非常重視的基礎原料。而所有的細胞培養(yǎng)基均含有氨基酸、維生素等必需的營養(yǎng)物質(zhì),它們是維持和促進細胞生長、增殖的主要因素。這些物質(zhì)含量的多少是衡量細胞培養(yǎng)基能否促進細胞生長的重要指標,也是檢定培養(yǎng)基是否符合工藝規(guī)定的質(zhì)量指標。因此,確立如何測定培養(yǎng)基中氨基酸的含量是細胞培養(yǎng)基生產(chǎn)廠商保證產(chǎn)品質(zhì)量的關鍵工作。氨基酸的分析方法在近幾年已得到了很大的改進和完善,衍生化測定是氨基酸兩類分析方法之一[2]。對于各種保健品及復合氨基酸制劑,目前較多的采用PICT柱前衍生試劑測定氨基酸[5][6]。PICT不僅毒性大,且需要專門的衍生裝置在無水條件下進行。AQC(6
3、-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基氨基甲酸酯)柱前衍生測定氨基酸可以獲得較好的結果[4],但分析時間較長,衍生試劑昂貴且不易購得。OPA和FMOC(鄰苯二甲醛一氯甲酸芴甲酯)聯(lián)用作為衍化試劑具有衍生反應迅速、分析周期檢短、檢測靈敏度高等特點,且衍生化過程完全自動化操作,使分析效率大為提高。我們使用HypersilC18分析柱,可變波長UV檢測器,OPA-FMOC柱前衍生測定細胞培養(yǎng)基M199中氨基酸含量,自動衍生進樣后經(jīng)梯度洗脫可以在20min內(nèi)使20種氨基酸完全分離。分離效果,重現(xiàn)性,線性范圍均令人滿意。1實驗部分1.1儀器和試劑HP公司1050型高效液相色譜儀、四元梯度
4、泵、自動進樣器、可變波長紫外檢測器、PhoenixDos化學工作站;分析天平BS210S,賽多利斯;pHS-3C數(shù)顯pH計,上海雷磁儀器廠;乙酸鈉、四氫呋喃和三乙胺為分析純;乙腈和甲醇為色譜純;OPA10mg/ml,F(xiàn)MOC2.5mg/ml為HP公司產(chǎn)品;氨基酸對照品為sigma公司產(chǎn)品;細胞培養(yǎng)基M199為無錫市美迪生物制品有限公司產(chǎn)品。1.2色譜條件色譜柱:HypersilODS柱,5μm,125×4mmid;流動相:A相:取20mM乙酸鈉+0.6%四氫呋喃+0.02%三乙胺,用稀醋酸調(diào)節(jié)PH至7.2。B相:100mM乙酸鈉(PH7.2)∶乙腈∶甲醇=100∶175∶2
5、25;流速:1.0ml/min;洗脫梯度:0.0-17.0minA相(%)100→40、B相(%)0→60,17.0-18.0minA相(%)40→0、B相(%)60→100;柱溫:40℃;波長切換:0-14.5min、338nm,14.5-20min、262nm;衍生化及進樣:5.0μl硼酸鹽緩沖液+1.0μlOPA液+1.0μl氨基酸液+1.0μlFMOC液按一定程序自動混勻反應后進樣。1.3對照品及樣品制備對照品儲備液:按M199配方,分別稱取各種氨基酸適量,精密稱定,用水溶解并稀釋至50ml作為對照品儲備液。供試品溶液:雖然M199中含有61種成分,但其中可溶性無機
6、鹽、葡萄糖、氨基酸占成分的98%以上,且各種難溶成分均通過不同工藝轉變?yōu)榭扇苄晕镔|(zhì),一些物質(zhì)又極微量,所以按配制說明制成溶液后,溶液澄清,pH為7.2,可以上機直接測定。2結果與討論2.1線性范圍、標準曲線及分離圖譜分別精密量取各種氨基酸對照品儲備液1、2、3、4、5ml,用水稀釋至100ml。按上述色譜條件測定各種氨基酸的線性范圍及標準曲線。結果表明,20種氨基酸在一定濃度范圍內(nèi)線性關系良好。精密量取各種氨基酸對照品儲備液2ml,置一100ml容量瓶中,用水稀釋至刻度,20種氨基酸的色譜分離結果。2.2回收率測定按細胞培養(yǎng)基M199配方配制試樣,按上述色譜條件連續(xù)進樣5次
7、,計算各氨基酸的回收率,20種氨基酸的平均回收率范圍是95.9~102.4%,RSD<3.8%(n=5)。2.3重現(xiàn)性試驗取2.1項下用于色譜分離的對照品溶液,按上述操作程序連續(xù)進樣6次,對方法的重現(xiàn)性進行考察。結果表明,20種氨基酸的RSD為0.08%~3.82%(n=6)。2.4樣品氨基酸含量測定精密稱取細胞培養(yǎng)基M199約10g,按說明書要求配制成溶液,即為供試品溶液。根據(jù)上述色譜條件進行分離分析,經(jīng)系統(tǒng)適用性實驗各氨基酸之間的分離度應大于1.0,以天門冬氨酸計算,理論塔板數(shù)應大于3000,采用外標法,