opa-fmoc柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基m199中氨基酸含量論文

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1、OPA/FMOC柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基M199中氨基酸含量論文【摘要】目的:該實(shí)驗(yàn)建立了以O(shè)PA/FMOC作為柱前衍生化試劑,采用高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中氨基酸含量的方法。在10~180μg.mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,.freelin內(nèi)使20種氨基酸完全分離。分離效果,重現(xiàn)性,線性范圍均令人滿意。1實(shí)驗(yàn)部分1.1儀器和試劑HP公司1050型高效液相色譜儀、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、PhoenixDos化學(xué)工作站;分析天平BS210S,賽多利斯;pHS-3C數(shù)顯pH計(jì),上海雷磁儀器廠;乙酸鈉、四氫呋

2、喃和三乙胺為分析純;乙腈和甲醇為色譜純;OPA10mg/ml,F(xiàn)MOC2.5mg/ml為HP公司產(chǎn)品;氨基酸對(duì)照品為sigma公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)基M199為無(wú)錫市美迪生物制品有限公司產(chǎn)品。1.2色譜條件色譜柱:HypersilODS柱,5μm,125×4mmid;流動(dòng)相:A相:取20mM乙酸鈉+0.6%四氫呋喃+0.02%三乙胺,用稀醋酸調(diào)節(jié)PH至7.2。B相:100mM乙酸鈉(PH7.2)∶乙腈∶甲醇=100∶175∶225;流速:1.0ml/min;洗脫梯度:0.0-17.0minA相(%)100→40、B相(%)0→60,17.0

3、-18.0minA相(%)40→0、B相(%)60→100;柱溫:40℃;波長(zhǎng)切換:0-14.5min、338nm,14.5-20min、262nm;衍生化及進(jìn)樣:5.0μl硼酸鹽緩沖液+1.0μlOPA液+1.0μl氨基酸液+1.0μlFMOC液按一定程序自動(dòng)混勻反應(yīng)后進(jìn)樣。1.3對(duì)照品及樣品制備對(duì)照品儲(chǔ)備液:按M199配方,分別稱取各種氨基酸適量,精密稱定,用水溶解并稀釋至50ml作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。供試品溶液:雖然M199中含有61種成分,但其中可溶性無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖、氨基酸占成分的98%以上,且各種難溶成分均通過(guò)不同工藝轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄?/p>

4、物質(zhì),一些物質(zhì)又極微量,所以按配制說(shuō)明制成溶液后,溶液澄清,pH為7.2,可以上機(jī)直接測(cè)定。2結(jié)果與討論2.1線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線及分離圖譜分別精密量取各種氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3、4、5ml,用水稀釋至100ml。按上述色譜條件測(cè)定各種氨基酸的線性范圍及標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,20種氨基酸在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密量取各種氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液2ml,置一100ml容量瓶中,用水稀釋至刻度,20種氨基酸的色譜分離結(jié)果。2.2回收率測(cè)定按細(xì)胞培養(yǎng)基M199配方配制試樣,按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次,計(jì)算各氨基酸的回收率,20種氨基酸的平

5、均回收率范圍是95.9~102.4%,RSD3.8%(n=5)。2.3重現(xiàn)性試驗(yàn)取2.1項(xiàng)下用于色譜分離的對(duì)照品溶液,按上述操作程序連續(xù)進(jìn)樣6次,對(duì)方法的重現(xiàn)性進(jìn)行考察。結(jié)果表明,20種氨基酸的RSD為0.08%~3.82%(n=6)。2.4樣品氨基酸含量測(cè)定精密稱取細(xì)胞培養(yǎng)基M199約10g,按說(shuō)明書要求配制成溶液,即為供試品溶液。根據(jù)上述色譜條件進(jìn)行分離分析,經(jīng)系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)各氨基酸之間的分離度應(yīng)大于1.0,以天門冬氨酸計(jì)算,理論塔板數(shù)應(yīng)大于3000,采用外標(biāo)法,將對(duì)照品溶液和供試品溶液分別注入色譜儀中。根據(jù)對(duì)照品溶液的濃度、峰面積

6、和供試品溶液的峰面積,計(jì)算供試品中氨基酸的含量。結(jié)果各氨基酸組分的含量均在標(biāo)示量的80%~100%之間。2.5討論本方法使用了兩種衍生化試劑,可迅速衍生一級(jí)、二級(jí)氨基酸,使所有20種氨基酸均生成較強(qiáng)熒光和紫外吸收衍生物。自動(dòng)進(jìn)樣器的使用,方便了衍生化步驟的操作。我們?cè)谶M(jìn)樣時(shí)設(shè)置自動(dòng)混勻程序,在抽取OPA后自動(dòng)混合20次,抽取FMOC后自動(dòng)混合30次,衍生化反應(yīng)完全,分析效率大為提高,也減少了誤差的產(chǎn)生。脯氨酸的最大吸收波長(zhǎng)在262nm,在338nm處?kù)`敏度較低,因此,我們?cè)O(shè)定在其他19個(gè)氨基酸出峰后切換波長(zhǎng)為262nm以提高脯氨酸檢測(cè)靈

7、敏度。進(jìn)行梯度洗脫,加快了氨基酸出峰時(shí)間,但應(yīng)注意的是兩種流動(dòng)相的pH需要嚴(yán)格控制在7.20,否則組氨酸與甘氨酸兩峰易粘連,使檢測(cè)誤差加大。細(xì)胞培養(yǎng)基的型號(hào)較多,含有的氨基酸種類及質(zhì)量均不相同,我們選取含氨基酸種類最多的M199作為試驗(yàn)對(duì)象,通過(guò)對(duì)M199中氨基酸含量檢測(cè)方法的建立,也可適用于其他細(xì)胞培養(yǎng)基中氨基酸的檢測(cè)。

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