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《有關(guān)流感病毒檢測(cè)方法的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、有關(guān)流感病毒檢測(cè)方法的研究[]目的比較多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(mRT-PCR)和膠體金法檢測(cè)流感病毒的敏感性和特異性。方法采用mRT-PCR和膠體金法檢測(cè)經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(HI)鑒定為A/H1、A/H3、B型流感病毒的鼻咽拭標(biāo)本78份,陰性鼻咽拭標(biāo)本40份,并對(duì)已稀釋成101-105病毒半數(shù)感染量(TCID50)/0.1mL的3株H1、H3、B型流感病毒進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果mRT-PCR對(duì)A型流感病毒的檢測(cè)敏感性為44.8%,特異性為97.5%;對(duì)B型流感病毒檢測(cè)敏感性為20.0%,特異性為100.0%。膠體金法對(duì)A型流感病毒檢測(cè)敏感性為44.8%,特
2、異性為100.0%;對(duì)B型流感病毒檢測(cè)敏感性為5.0%,特異性為97.5%。結(jié)論mRT-PCR和膠體金法的敏感性與特異性無(wú)差異;mRT-PCR和膠體金法均可用于人群流感鼻咽拭標(biāo)本流感病毒快速檢測(cè),特別是聚集性暴發(fā)流感患者,建議采樣時(shí)標(biāo)本數(shù)要適當(dāng)放大2-3倍。 [關(guān)鍵詞]流感病毒分離膠體金法 []R373.1+3[]A[]1005-0515（2011）-08-317-01 1材料和方法 1.1試驗(yàn)材料標(biāo)本來(lái)自某人民醫(yī)院兒童醫(yī)院分部和醫(yī)院兒內(nèi)科,從就診流感樣病例及肺炎病例(體溫≥38℃)采集鼻咽拭子;如果局部有疑似流感暴發(fā),由市、區(qū)疾控中心采集標(biāo)本。標(biāo)本采集后冷
3、鏈12h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,24h內(nèi)進(jìn)行流感病毒分離培養(yǎng)和快速檢測(cè)試驗(yàn)。24h內(nèi)不能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的咽拭標(biāo)本即置-70℃低溫冰箱保存待測(cè)?！ ?.2實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1病毒分離培養(yǎng)與鑒定采用20代內(nèi)狗腎細(xì)胞(MDCK)分離培養(yǎng)。標(biāo)本預(yù)處理:3mL標(biāo)本加150μL“四抗”2-8℃冰箱過(guò)夜。將已長(zhǎng)成單層的MDCK用含0.02mL/mL“四抗”基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗2次,接種150-300μL標(biāo)本,34℃吸附1-2h后,吸棄標(biāo)本液,加培養(yǎng)維持液(終濃度為5μg/mL胰酶、各50μL/mL“四抗”、0.2%小牛血清白蛋白),置35℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),24h后逐日觀察細(xì)胞病變,1周后對(duì)所
4、有的細(xì)胞培養(yǎng)液用0.75%的人“O”型紅細(xì)胞作微量血凝實(shí)驗(yàn)。血凝陽(yáng)性培養(yǎng)液用國(guó)家流感中心統(tǒng)一下發(fā)的已知亞型血清作HI,鑒定所分離流感病毒的型別?！ ?.2.2病毒半數(shù)感染量(TCID50)測(cè)定用A/江蘇北塘/122/2008(H1)、A/江蘇北塘/149/2008(H3)、B/江蘇北塘/137/2008已知陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行10-1—10-7稀釋,在已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔微量細(xì)胞板上用MDCK病變法進(jìn)行TCID50測(cè)定。各稀釋度接種10孔,每孔接種0.1mL,接種方法同病毒分離,33-35℃、5%CO2一周判讀TCID50結(jié)果。A/江蘇北塘/122/2008(H1)為10
5、6.2TCID50/0.1mL、A/江蘇北塘/149/2008(H3)為106.5TCID50/0.1mL、B/江蘇北塘/137/2008為106.5TCID50/0.1mL?！ ?結(jié)果 2.1mRT-PCR與膠體金法檢測(cè)結(jié)果mRT-PCR和膠體金法檢測(cè)經(jīng)傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)、HI鑒定已知A型流感病毒陽(yáng)性的2008年鼻咽拭標(biāo)本58份,已知B型流感病毒陽(yáng)性鼻咽拭標(biāo)本20份;已知流感病毒陰性鼻咽拭標(biāo)本40份。mRT-PCR對(duì)A型流感病毒檢測(cè)敏感性為是44.8%(26/58),特異性為97.5%(39/40);對(duì)B型流感病毒檢測(cè)敏感性為20.0%(4/20),特異性為100.0
6、%(40/40)。膠體金法對(duì)A型流感病毒檢測(cè)敏感性為44.8%(26/58),特異性為100.0%(0/40);對(duì)B型流感病毒檢測(cè)敏感性為5.0%(1/20),特異性為97.5%(39/40)。mRTPCR和膠體金法對(duì)A、B型流感病毒陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.8725、0.6794)?！ ?.2mRT-PCR、膠體金法檢測(cè)敏感性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)已稀釋成10-10TCID50/0.1mL的已知A/江蘇北塘/122/2008(H1)、A/江蘇北塘/149/2008(H3)、B/江蘇北塘/137/2008流感病毒分離陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行mRT-PCR、膠體金法檢測(cè)敏感性試驗(yàn)。
7、結(jié)果mRT-PCR的敏感性為103TCID50/0.1mL。膠體金法也為103TCID50/0.1mL,且3次結(jié)果相同?！ ?討論本研究結(jié)果顯示,mRT-PCR和膠體金法的病毒檢出敏感性均為103TCID50/0.1mL。而在對(duì)疑似流感患者鼻咽拭子標(biāo)本進(jìn)行病毒分離時(shí)發(fā)現(xiàn),約90%左右的標(biāo)本在接種細(xì)胞后3-4d出現(xiàn)細(xì)胞病變,說(shuō)明大部分鼻咽拭子標(biāo)本中病毒含量在101-102TCID50/0.1mL左右。用PCR對(duì)cDNA進(jìn)行檢測(cè)的敏感性可達(dá)0.02-0.1TCID50/0.1mL,其檢測(cè)的敏感性不容置疑,但由于流感病毒為RNA病毒,還涉及病毒RNA抽提過(guò)程中的損失以
