9.流感病毒的快速檢測(cè)方法

《9.流感病毒的快速檢測(cè)方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、流感病毒的快速檢測(cè)方法一、RT-PCR快速診斷方法（一）生物安全要求（二）病毒核酸提取（三）RT-PCR（四）PCR產(chǎn)物純化（五）流感病毒RT-PCR檢測(cè)引物二、免疫熒光方法檢測(cè)流感病毒（一）原理（二）標(biāo)本處理（三）間接免疫熒光法（四）結(jié)果判斷三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimePCR）快速診斷檢測(cè)（一）基本原理（二）實(shí)驗(yàn)試劑（三）實(shí)驗(yàn)步驟四、快速診斷試劑盒流感的快速檢測(cè)方法，與傳統(tǒng)的病毒分離鑒定相比具有快速、簡便的特點(diǎn)。因此常用于流感暴發(fā)時(shí)早期病原學(xué)檢測(cè)用。流感的快速診斷包括直接和間接免疫熒光法、ELISA、RT-PCR、Real-TimeP

2、CR快速診斷速方法、流感快速診斷試劑盒等。這里介紹RT-PCR、Real-TimePCR、免疫熒光快速診斷速診斷方法和幾種流感快速診斷試劑盒優(yōu)缺點(diǎn)。無論那種快速診斷都無法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的病毒分離鑒定方法。一、RT-PCR快速診斷方法核酸檢測(cè)是一種鑒定流感病毒基因組的有力方法，即使基因組含量很低或死病毒也可以檢測(cè)到。本章將介紹檢測(cè)流感病毒的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。流感病毒的基因組是負(fù)鏈RNA，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增前必須合成與病毒RNA互補(bǔ)的DNA，即為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，擴(kuò)增流感病毒基因組的過程稱為RT-PCR。RT-

3、PCR需要一對(duì)型別特異引物，四種脫氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆轉(zhuǎn)錄酶及TaqDNA多聚酶；首先由逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后再進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)經(jīng)25～30個(gè)循環(huán)，使DNA產(chǎn)物達(dá)到倍增的效果。（一）生物安全要求生物安全級(jí)別與個(gè)人防護(hù)要求：生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室，防護(hù)要求與二級(jí)實(shí)驗(yàn)室的要求相同。并應(yīng)遵守相應(yīng)的生物安全規(guī)定。進(jìn)行高致病性禽H5RT-PCR快速檢測(cè)時(shí)可以在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行，核酸提取在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜里完成。（一）病毒核酸提取1.實(shí)驗(yàn)材料及儀器(1)QIAGEN公司的RneasyMiniKit（Ca

4、talog#74104）(2)β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）(3)70%乙醇(4)無菌1.5ml離心管(5)10μl、20μl、200μl、1000μl加樣器和槍頭(6)可調(diào)14K微型離心機(jī)(7)旋轉(zhuǎn)混合器2.操作步驟(1)取1支無菌、無RNA酶的1.5mlEppendorf管，加入500μlRLT。(2)取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）100μl，加入上述Eppendorf管中。(3)加5μlβ-巰基乙醇，充分混勻。(4)加600μl70%乙醇，于旋轉(zhuǎn)混合器混勻。(5)從試劑盒中取出帶濾膜

5、的離心柱，并標(biāo)上標(biāo)本號(hào)。(6)將第4步的混合液體分兩次（每次600μl）吸入于濾柱中，12000rpm離心15秒，棄收集管中的離心液。(7)濾柱仍放回收集管上，將第4步的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm離心15秒，棄收集管中液體。(8)于濾柱中加入700μlRW1，12000rpm離心15秒。(9)從試劑盒中取出一支新的2ml收集管，將離心后的濾柱轉(zhuǎn)到新的收集管上，于柱子中加入500μlRPE，12000rpm離心15秒棄收集管中液體。(10)濾柱放回收集管上，于濾柱中加入500μlRPE，13000～14000rpm離心2分鐘。(11)從試劑

6、盒中取出一支1.5mlEppendorf管，將濾柱轉(zhuǎn)到新的1.5ml管上，于濾柱中加入30～50μl無RNA酶的水，室溫靜置1～3分鐘。(12)12000rpm離心1分鐘，棄濾柱。收集的離心液即為提取病毒的RNA，可以直接用于逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，或在-20℃以下保存，-30℃可保存3～4個(gè)月。3.注意事項(xiàng)(1)試劑盒中的RPE液用前需加44ml無水乙醇，使終體積達(dá)到55ml。(2)所有用過的槍頭、收集管放入2%次氯酸鈉消毒缸中過夜。（二）RT-PCR1.一步法RT-PCR(1)實(shí)驗(yàn)材料1)QIAGENOneStepRT-PCRKitCatNo2102122)

7、RNaseinhibitor40u/μl（Promega）3)上游引物200ng/μl4)下游引物200ng/μl1)模板RNA（TempletRNA）(2)實(shí)驗(yàn)步驟1)PCR反應(yīng)配置（在清潔區(qū)緩沖間，加RNA模板應(yīng)在核酸室）無RNA酶水（RnaseFreeWater）28.75μl5×Buffer10μl10mMdNTP2μlEnzymeMix2μlRnaseinhibitor0.25μl上游引物1μl下游引物1μlRNA模板5μl總量：50μl2)將PCR反應(yīng)管放入PCR擴(kuò)增儀3)RT-PCR反應(yīng)條件：此循環(huán)的反應(yīng)條件僅共參考，如果引物更換，相應(yīng)

8、的反應(yīng)條件需要做適當(dāng)調(diào)整。?60℃1min?42℃10min?50℃30min?95℃15min?94℃30