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1、有關流感病毒檢測方法的研究[]目的比較多重逆轉錄聚合酶鏈反應(mRT-PCR)和膠體金法檢測流感病毒的敏感性和特異性。方法采用mRT-PCR和膠體金法檢測經細胞培養(yǎng)和紅細胞凝集抑制試驗(HI)鑒定為A/H1、A/H3、B型流感病毒的鼻咽拭標本78份,陰性鼻咽拭標本40份,并對已稀釋成101-105病毒半數感染量(TCID50)/0.1mL的3株H1、H3、B型流感病毒進行敏感性試驗。結果mRT-PCR對A型流感病毒的檢測敏感性為44.8%,特異性為97.5%;對B型流感病毒檢測敏感性為20.0%,特異性為100.0%。膠體金法對A型流感病毒檢測敏感性為44.8%,特
2、異性為100.0%;對B型流感病毒檢測敏感性為5.0%,特異性為97.5%。結論mRT-PCR和膠體金法的敏感性與特異性無差異;mRT-PCR和膠體金法均可用于人群流感鼻咽拭標本流感病毒快速檢測,特別是聚集性暴發(fā)流感患者,建議采樣時標本數要適當放大2-3倍?！ 關鍵詞]流感病毒分離膠體金法 []R373.1+3[]A[]1005-0515（2011）-08-317-01 1材料和方法 1.1試驗材料標本來自某人民醫(yī)院兒童醫(yī)院分部和醫(yī)院兒內科,從就診流感樣病例及肺炎病例(體溫≥38℃)采集鼻咽拭子;如果局部有疑似流感暴發(fā),由市、區(qū)疾控中心采集標本。標本采集后冷
3、鏈12h內運送至實驗室,24h內進行流感病毒分離培養(yǎng)和快速檢測試驗。24h內不能進行實驗的咽拭標本即置-70℃低溫冰箱保存待測。 1.2實驗方法 1.2.1病毒分離培養(yǎng)與鑒定采用20代內狗腎細胞(MDCK)分離培養(yǎng)。標本預處理:3mL標本加150μL“四抗”2-8℃冰箱過夜。將已長成單層的MDCK用含0.02mL/mL“四抗”基礎培養(yǎng)基洗2次,接種150-300μL標本,34℃吸附1-2h后,吸棄標本液,加培養(yǎng)維持液(終濃度為5μg/mL胰酶、各50μL/mL“四抗”、0.2%小牛血清白蛋白),置35℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),24h后逐日觀察細胞病變,1周后對所
4、有的細胞培養(yǎng)液用0.75%的人“O”型紅細胞作微量血凝實驗。血凝陽性培養(yǎng)液用國家流感中心統(tǒng)一下發(fā)的已知亞型血清作HI,鑒定所分離流感病毒的型別?！ ?.2.2病毒半數感染量(TCID50)測定用A/江蘇北塘/122/2008(H1)、A/江蘇北塘/149/2008(H3)、B/江蘇北塘/137/2008已知陽性標本進行10-1—10-7稀釋,在已長成單層細胞的96孔微量細胞板上用MDCK病變法進行TCID50測定。各稀釋度接種10孔,每孔接種0.1mL,接種方法同病毒分離,33-35℃、5%CO2一周判讀TCID50結果。A/江蘇北塘/122/2008(H1)為10
5、6.2TCID50/0.1mL、A/江蘇北塘/149/2008(H3)為106.5TCID50/0.1mL、B/江蘇北塘/137/2008為106.5TCID50/0.1mL?！ ?結果 2.1mRT-PCR與膠體金法檢測結果mRT-PCR和膠體金法檢測經傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)、HI鑒定已知A型流感病毒陽性的2008年鼻咽拭標本58份,已知B型流感病毒陽性鼻咽拭標本20份;已知流感病毒陰性鼻咽拭標本40份。mRT-PCR對A型流感病毒檢測敏感性為是44.8%(26/58),特異性為97.5%(39/40);對B型流感病毒檢測敏感性為20.0%(4/20),特異性為100.0
6、%(40/40)。膠體金法對A型流感病毒檢測敏感性為44.8%(26/58),特異性為100.0%(0/40);對B型流感病毒檢測敏感性為5.0%(1/20),特異性為97.5%(39/40)。mRTPCR和膠體金法對A、B型流感病毒陽性檢出率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.8725、0.6794)?！ ?.2mRT-PCR、膠體金法檢測敏感性試驗結果對已稀釋成10-10TCID50/0.1mL的已知A/江蘇北塘/122/2008(H1)、A/江蘇北塘/149/2008(H3)、B/江蘇北塘/137/2008流感病毒分離陽性標本進行mRT-PCR、膠體金法檢測敏感性試驗。
7、結果mRT-PCR的敏感性為103TCID50/0.1mL。膠體金法也為103TCID50/0.1mL,且3次結果相同?！ ?討論本研究結果顯示,mRT-PCR和膠體金法的病毒檢出敏感性均為103TCID50/0.1mL。而在對疑似流感患者鼻咽拭子標本進行病毒分離時發(fā)現(xiàn),約90%左右的標本在接種細胞后3-4d出現(xiàn)細胞病變,說明大部分鼻咽拭子標本中病毒含量在101-102TCID50/0.1mL左右。用PCR對cDNA進行檢測的敏感性可達0.02-0.1TCID50/0.1mL,其檢測的敏感性不容置疑,但由于流感病毒為RNA病毒,還涉及病毒RNA抽提過程中的損失以
