丙型肝炎病毒不同編碼區(qū)his融合抗原的表達與純化

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1、丙型肝炎病毒不同編碼區(qū)His融合抗原的表達與純化作者：韓振格，喬偉振，張敏，孫艷雯，董晨，孟繼鴻【摘要】目的：表達和純化丙型肝炎病毒（HCV）Core、NS3和NS4的His融合抗原HC、HNS3和HNS4，并初步探討其在抗體檢測中的應用。方法：用重組基因工程技術，構建3種重組質粒CpET28ac(+)、NS3pET28ac(+)和NS4pET28ac(+)以及相應的工程菌；質粒經雙酶切、PCR和測序鑒定正確后，IPTG誘導抗原表達，從IPTG使用濃度、誘導溫度與時間3個方面優(yōu)

2、化抗原表達條件；用NTA柱純化抗原后，分別用單片段重組抗原和混合抗原以酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測100份HCV抗體陽性血清和40份健康人血清。結果：用單片段重組抗原和混合抗原檢測的100份HCV抗體陽性血清中，HC、HNS3和HNS4的抗體陽性率分別為91%、75%和52%，而HC、HNS3和HNS4混合抗原的抗體檢出率為100%；檢測40份健康人血清，結果全部為陰性。結論：HCV不同編碼區(qū)單片段His融合抗原具有不同的抗體檢出率，但均低于混合抗原的陽性率；在開發(fā)HCV抗體診斷試劑時

3、，應采用HCV混合抗原?！娟P鍵詞】丙型肝炎病毒；His融合抗原；抗原純化；表達常用的HCV感染診斷方法主要是用ELISA檢測抗HCV。目前，國內外HCV抗體檢測試劑均已開發(fā)了3代產品，其包被抗原大多采用基因工程抗原［12］，主要包括HCVCore、NS3和NS4。雖然現在普遍應用的第3代ELISA檢測試劑的質量較前兩代有了很大提高［3］，但仍存在一定程度的假陽性和漏檢［48］，如何提高HCV抗體ELISA檢測試劑的質量是一個亟待解決的問題。而探索和開發(fā)更好的HCV抗原，是完善抗體檢測試劑盒的關鍵

4、。我們在以往研究HCV重組抗原［910］的基礎上，應用基因工程的方法，表達和純化HCVHis融合抗原HC、HNS3和HNS4，用血清學方法對其抗原性進行了初步鑒定，為進一步研制高質量的HCV抗體檢測試劑奠定基礎。1材料和方法1.1重組質粒的構建與鑒定以3種重組質粒CpGEX4T2、NS3pGEX4T2和NS4pGEX4T2（美國CDC惠贈）為模板，分別用PCR方法擴增HCV結構與非結構區(qū)基因Core、NS3和NS4。PCR擴增條件：94℃預變性2min；然后92℃變性45s，5

5、4℃退火45s，72℃延伸1min30s，共35個循環(huán)；最后一個循環(huán)結束后延伸8min。PCR產物用3SSpinDNAAgaroseGelPurificationKit（上海申能博彩生物科技有限公司）回收。質粒載體pET28ac(+)和PCR產物分別用BamHⅠ和XhoⅠ酶切；將酶切后的3種PCR產物分別與酶切后的質粒載體pET28ac(+)連接；取5μl連接產物轉化100μl大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，取100μl菌液涂布于含硫酸卡那霉素（K+）的LB培養(yǎng)基平板，涂勻后置37℃培養(yǎng)過夜。挑取能

6、在K+LB培養(yǎng)基上生長的菌落接種K+LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。用PlusMiniprepsDNAPurificationSystems（Promega）抽提質粒。重組質粒經PCR、雙酶切、測序進行鑒定。1.2His融合抗原的誘導表達將鑒定正確的重組質粒[CpET28ac(+)、NS3pET28ac(+)、NS4pET28ac(+)]分別轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細菌。取100μl菌液涂布于K+LB培養(yǎng)基平板，涂勻后置37℃培養(yǎng)過夜。挑取在K+LB培養(yǎng)基上生長的菌落接種K+LB

7、液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，次日轉1ml過夜培養(yǎng)菌液至100mlK+LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm=0.6，平均分入5支已高壓滅菌的50ml大試管，再加入IPTG(Sigma)至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8及1.0mmol·L－1，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1h，收集細菌沉淀，SDS/PAGE確定抗原表達量較高時所需較低的IPTG濃度（即適宜誘導劑濃度）；用此濃度IPTG，分別在25、28、30、35及37℃誘導抗原表達的收集細菌沉淀，SDS/PAGE確定抗原表達量較高時的適宜

8、誘導溫度；用適宜IPTG濃度，在適宜的誘導溫度下誘導抗原表達0.5、1、1.5、2及3h，收集細菌沉淀，超聲裂解細菌，4℃10000r·min－1離心15min，分別收集細菌裂解上清和沉淀，SDS/PAGE確定適宜誘導表達時間，了解抗原的表達方式（可溶性/包涵體），初步制定抗原純化方案。1.3His融合抗原純化在優(yōu)化的表達條件下擴大細菌培養(yǎng)，誘導抗原表達，收集細菌沉淀。用50mmol·L－1TrisHCl（pH8.0）緩沖液（含有1mg·