丙型肝炎病毒不同編碼區(qū)his融合抗原的表達(dá)與純化

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1、丙型肝炎病毒不同編碼區(qū)His融合抗原的表達(dá)與純化作者：韓振格，喬偉振，張敏，孫艷雯，董晨，孟繼鴻【摘要】目的：表達(dá)和純化丙型肝炎病毒（HCV）Core、NS3和NS4的His融合抗原HC、HNS3和HNS4，并初步探討其在抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。方法：用重組基因工程技術(shù)，構(gòu)建3種重組質(zhì)粒CpET28ac(+)、NS3pET28ac(+)和NS4pET28ac(+)以及相應(yīng)的工程菌；質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、PCR和測(cè)序鑒定正確后，IPTG誘導(dǎo)抗原表達(dá)，從IPTG使用濃度、誘導(dǎo)溫度與時(shí)間3個(gè)方面優(yōu)

2、化抗原表達(dá)條件；用NTA柱純化抗原后，分別用單片段重組抗原和混合抗原以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)100份HCV抗體陽(yáng)性血清和40份健康人血清。結(jié)果：用單片段重組抗原和混合抗原檢測(cè)的100份HCV抗體陽(yáng)性血清中，HC、HNS3和HNS4的抗體陽(yáng)性率分別為91%、75%和52%，而HC、HNS3和HNS4混合抗原的抗體檢出率為100%；檢測(cè)40份健康人血清，結(jié)果全部為陰性。結(jié)論：HCV不同編碼區(qū)單片段His融合抗原具有不同的抗體檢出率，但均低于混合抗原的陽(yáng)性率；在開發(fā)HCV抗體診斷試劑時(shí)

3、，應(yīng)采用HCV混合抗原?！娟P(guān)鍵詞】丙型肝炎病毒；His融合抗原；抗原純化；表達(dá)常用的HCV感染診斷方法主要是用ELISA檢測(cè)抗HCV。目前，國(guó)內(nèi)外HCV抗體檢測(cè)試劑均已開發(fā)了3代產(chǎn)品，其包被抗原大多采用基因工程抗原［12］，主要包括HCVCore、NS3和NS4。雖然現(xiàn)在普遍應(yīng)用的第3代ELISA檢測(cè)試劑的質(zhì)量較前兩代有了很大提高［3］，但仍存在一定程度的假陽(yáng)性和漏檢［48］，如何提高HCV抗體ELISA檢測(cè)試劑的質(zhì)量是一個(gè)亟待解決的問題。而探索和開發(fā)更好的HCV抗原，是完善抗體檢測(cè)試劑盒的關(guān)鍵

4、。我們?cè)谝酝芯縃CV重組抗原［910］的基礎(chǔ)上，應(yīng)用基因工程的方法，表達(dá)和純化HCVHis融合抗原HC、HNS3和HNS4，用血清學(xué)方法對(duì)其抗原性進(jìn)行了初步鑒定，為進(jìn)一步研制高質(zhì)量的HCV抗體檢測(cè)試劑奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定以3種重組質(zhì)粒CpGEX4T2、NS3pGEX4T2和NS4pGEX4T2（美國(guó)CDC惠贈(zèng)）為模板，分別用PCR方法擴(kuò)增HCV結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)區(qū)基因Core、NS3和NS4。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2min；然后92℃變性45s，5

5、4℃退火45s，72℃延伸1min30s，共35個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后延伸8min。PCR產(chǎn)物用3SSpinDNAAgaroseGelPurificationKit（上海申能博彩生物科技有限公司）回收。質(zhì)粒載體pET28ac(+)和PCR產(chǎn)物分別用BamHⅠ和XhoⅠ酶切；將酶切后的3種PCR產(chǎn)物分別與酶切后的質(zhì)粒載體pET28ac(+)連接；取5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μl大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取100μl菌液涂布于含硫酸卡那霉素（K+）的LB培養(yǎng)基平板，涂勻后置37℃培養(yǎng)過夜。挑取能

6、在K+LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落接種K+LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。用PlusMiniprepsDNAPurificationSystems（Promega）抽提質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切、測(cè)序進(jìn)行鑒定。1.2His融合抗原的誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定正確的重組質(zhì)粒[CpET28ac(+)、NS3pET28ac(+)、NS4pET28ac(+)]分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)菌。取100μl菌液涂布于K+LB培養(yǎng)基平板，涂勻后置37℃培養(yǎng)過夜。挑取在K+LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落接種K+LB

7、液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)1ml過夜培養(yǎng)菌液至100mlK+LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm=0.6，平均分入5支已高壓滅菌的50ml大試管，再加入IPTG(Sigma)至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8及1.0mmol·L－1，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1h，收集細(xì)菌沉淀，SDS/PAGE確定抗原表達(dá)量較高時(shí)所需較低的IPTG濃度（即適宜誘導(dǎo)劑濃度）；用此濃度IPTG，分別在25、28、30、35及37℃誘導(dǎo)抗原表達(dá)的收集細(xì)菌沉淀，SDS/PAGE確定抗原表達(dá)量較高時(shí)的適宜

8、誘導(dǎo)溫度；用適宜IPTG濃度，在適宜的誘導(dǎo)溫度下誘導(dǎo)抗原表達(dá)0.5、1、1.5、2及3h，收集細(xì)菌沉淀，超聲裂解細(xì)菌，4℃10000r·min－1離心15min，分別收集細(xì)菌裂解上清和沉淀，SDS/PAGE確定適宜誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間，了解抗原的表達(dá)方式（可溶性/包涵體），初步制定抗原純化方案。1.3His融合抗原純化在優(yōu)化的表達(dá)條件下擴(kuò)大細(xì)菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗原表達(dá)，收集細(xì)菌沉淀。用50mmol·L－1TrisHCl（pH8.0）緩沖液（含有1mg·