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《rnai抑制nek293細(xì)胞tgfβ1表達(dá)的研究論文》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、RNAi抑制NEK293細(xì)胞TGFβ1表達(dá)的研究論文崔飛倫,邱鎮(zhèn),陸洪兵,姚震,林大春【摘要】目的:探討針對轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)的小干擾RNA(siRNA)對大鼠腎間質(zhì)細(xì)胞系(NEK293)TGFβ1的表達(dá)、細(xì)胞周期的抑制及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用.方法:利用RNA干擾(RNAi)效應(yīng)設(shè)計(jì)針對TGFβ1的不同siRNA,構(gòu)建表達(dá)載體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染NEK293細(xì)胞系.RTPCR和TT)、碘化丙啶(PI)熒光染料、TritonX100打孔劑(美國Sigma公司);DOSPER脂質(zhì)體(美國Roche公司);熒光顯微鏡(德國Opton公司);TECANsunrise型自動(dòng)酶
2、聯(lián)免疫檢測儀,coulterEpicsXL流式細(xì)胞儀,LS6500液閃計(jì)數(shù)儀(美國Beckman公司).1.2方法1.2.1特異性siRNA設(shè)計(jì)及載體的構(gòu)建候選siRNA序列通過BLAST工具搜索,去掉與人類RNAs同源性的靶序列,最后選取3個(gè)siRNA.根據(jù)pSilencer3.1H1質(zhì)粒載體使用說明,將編碼siRNA的雙鏈互補(bǔ)DNA片段插入該載體的BamHI/HindⅢ位點(diǎn)之間以制備發(fā)夾cDNAs[3].表達(dá)這3種siRNA的重組質(zhì)粒分別命名為psiRNA1,2,3.以BamHI和HindⅢ酶切后電泳觀察酶切特異性片段的大小,并對純化的siRNA片段進(jìn)行DNA測序
3、分析.另合成一不針對任何基因的無意義片段作為對照.1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞以含100mL/L滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,于37℃,50mL/LCO2,飽和濕度培養(yǎng),2d換液1次.取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).按lipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將5μgpsiRNA(13)和無意義對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中,6h后更換正常培養(yǎng)基,12h后熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率.1.2.3RTPCR檢測psiRNA1,2,3三個(gè)實(shí)驗(yàn)組及對照組分別收集細(xì)胞(細(xì)胞總數(shù)為1×107個(gè))按Trizol試劑操作步驟提取總RNA,選用一步法
4、RTPCR試劑盒.具體參數(shù)及條件根據(jù)引物的Tm值和擴(kuò)增片斷的大小進(jìn)行調(diào)整.1.2.4TT比色實(shí)驗(yàn)1×104HEK293細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,37℃,50mL/LCO2,飽和濕度培養(yǎng)1d.按實(shí)驗(yàn)要求分別在細(xì)胞中加入終濃度為200nmol/L的siRNA,中止培養(yǎng)4h前加入MTT,應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測.檢測490nm波長處的吸光度A值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率:增殖抑制率(%)=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照組)×100%.1.2.6細(xì)胞凋亡檢測3mL培養(yǎng)液含5×105細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板,用預(yù)冷的700mg/L乙醇固定,4℃過夜,PI(50mg/L)染色,分析亞二倍體峰.調(diào)整細(xì)胞密度為5×106
5、/mL,取1mL細(xì)胞懸液,1000r/min4℃離心10min,重復(fù)2次,將細(xì)胞重懸于200μL結(jié)合緩沖液,加入10μL膜連蛋白Ⅴ(AnnexinV2FITC)和5μL碘化丙錠(PI),避光室溫反應(yīng)15min,加入300μL結(jié)合緩沖液,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況.1.2.7轉(zhuǎn)染效率的檢測試劑盒中提供帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的載體作為陽性對照用以監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率.按說明書轉(zhuǎn)染,24h后收集細(xì)胞,PBS洗滌后固定在20g/L多聚甲醛中,流式細(xì)胞儀檢測.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:以SPSS11.0軟件進(jìn)行分析.組間差異比較采用方差分析及LSDt檢驗(yàn),P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2
6、.1siRNA轉(zhuǎn)染效率流式細(xì)胞分析顯示,幾乎所有的細(xì)胞都攝取了GFP的綠色熒光.由于siRNA分子遠(yuǎn)小于質(zhì)粒分子,故轉(zhuǎn)染siRNA時(shí)轉(zhuǎn)染效率應(yīng)大于70%(圖1).A:siRNA1組;B:siRNA2組;C:siRNA3組.圖1各實(shí)驗(yàn)組siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染×200(略)2.2TGFβ1mRNA及蛋白的表達(dá)特異性siRNA處理后24hTGFβ1mRNA表達(dá)水平明顯降低,與非特異性siRNA組mRNA的表達(dá)水平相比較有顯著差異(表1,圖2).特異性siRNA轉(zhuǎn)染24hTGFβ1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),與非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,TGFβ1mRNA及蛋
7、白表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組間無顯著差異(表1,圖3).表1脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染24h后對TGFβ1表達(dá)的影響(略)aP0.05vs陰性siRNA對照和陽性siRNA對照.A:非特異性siRNA對照;B:特異性TGFbetasiRNA1;C:特異性TGFbetasiRNA2;D:特異性TGFbetasiRNA3;M:DNAmarker.圖2RTPCR檢測TGFβ1siRNA轉(zhuǎn)染后TGFβ1mRNA表達(dá)(略)A:陰性siRNA對照;B:陽性GAPDHsiRNA對照;C:特異