rnai抑制nek293細胞tgfβ1表達的研究論文

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1、RNAi抑制NEK293細胞TGFβ1表達的研究論文崔飛倫，邱鎮(zhèn)，陸洪兵，姚震，林大春【摘要】目的：探討針對轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）的小干擾RNA（siRNA）對大鼠腎間質(zhì)細胞系（NEK293）TGFβ1的表達、細胞周期的抑制及細胞凋亡的誘導作用.方法：利用RNA干擾（RNAi）效應設計針對TGFβ1的不同siRNA，構(gòu)建表達載體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染NEK293細胞系.RTPCR和TT）、碘化丙啶（PI）熒光染料、TritonX100打孔劑（美國Sigma公司）；DOSPER脂質(zhì)體（美國Roche公司）；熒光顯微鏡（德國Opton公司）；TECANsunrise型自動酶

2、聯(lián)免疫檢測儀，coulterEpicsXL流式細胞儀，LS6500液閃計數(shù)儀（美國Beckman公司）.1.2方法1.2.1特異性siRNA設計及載體的構(gòu)建候選siRNA序列通過BLAST工具搜索,去掉與人類RNAs同源性的靶序列，最后選取3個siRNA.根據(jù)pSilencer3.1H1質(zhì)粒載體使用說明，將編碼siRNA的雙鏈互補DNA片段插入該載體的BamHI/HindⅢ位點之間以制備發(fā)夾cDNAs［3］.表達這3種siRNA的重組質(zhì)粒分別命名為psiRNA1,2,3.以BamHI和HindⅢ酶切后電泳觀察酶切特異性片段的大小，并對純化的siRNA片段進行DNA測序

3、分析.另合成一不針對任何基因的無意義片段作為對照.1.2.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HEK293細胞以含100mL/L滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃，50mL/LCO2，飽和濕度培養(yǎng)，2d換液1次.取對數(shù)生長期細胞進行實驗.按lipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將5μgpsiRNA(13)和無意義對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中，6h后更換正常培養(yǎng)基，12h后熒光顯微鏡及流式細胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率.1.2.3RTPCR檢測psiRNA1,2,3三個實驗組及對照組分別收集細胞（細胞總數(shù)為1×107個）按Trizol試劑操作步驟提取總RNA，選用一步法

4、RTPCR試劑盒.具體參數(shù)及條件根據(jù)引物的Tm值和擴增片斷的大小進行調(diào)整.1.2.4TT比色實驗1×104HEK293細胞接種于96孔培養(yǎng)板,37℃，50mL/LCO2，飽和濕度培養(yǎng)1d.按實驗要求分別在細胞中加入終濃度為200nmol/L的siRNA，中止培養(yǎng)4h前加入MTT，應用酶標儀進行檢測.檢測490nm波長處的吸光度A值,計算細胞增殖抑制率：增殖抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%.1.2.6細胞凋亡檢測3mL培養(yǎng)液含5×105細胞培養(yǎng)于6孔板，用預冷的700mg/L乙醇固定，4℃過夜，PI（50mg/L）染色，分析亞二倍體峰.調(diào)整細胞密度為5×106

5、/mL，取1mL細胞懸液，1000r/min4℃離心10min，重復2次，將細胞重懸于200μL結(jié)合緩沖液，加入10μL膜連蛋白Ⅴ(AnnexinV2FITC)和5μL碘化丙錠(PI)，避光室溫反應15min，加入300μL結(jié)合緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況.1.2.7轉(zhuǎn)染效率的檢測試劑盒中提供帶有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的載體作為陽性對照用以監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率.按說明書轉(zhuǎn)染,24h后收集細胞,PBS洗滌后固定在20g/L多聚甲醛中,流式細胞儀檢測.統(tǒng)計學處理：以SPSS11.0軟件進行分析.組間差異比較采用方差分析及LSDt檢驗，P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義.2結(jié)果2

6、.1siRNA轉(zhuǎn)染效率流式細胞分析顯示，幾乎所有的細胞都攝取了GFP的綠色熒光.由于siRNA分子遠小于質(zhì)粒分子，故轉(zhuǎn)染siRNA時轉(zhuǎn)染效率應大于70%（圖1）.A:siRNA1組;B:siRNA2組;C:siRNA3組.圖1各實驗組siRNA表達載體轉(zhuǎn)染×200（略）2.2TGFβ1mRNA及蛋白的表達特異性siRNA處理后24hTGFβ1mRNA表達水平明顯降低，與非特異性siRNA組mRNA的表達水平相比較有顯著差異（表1，圖2）.特異性siRNA轉(zhuǎn)染24hTGFβ1蛋白表達水平明顯下調(diào)，與非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組比較差異有統(tǒng)計學意義，TGFβ1mRNA及蛋

7、白表達在實驗組間無顯著差異（表1，圖3）.表1脂質(zhì)體介導的siRNA表達載體轉(zhuǎn)染24h后對TGFβ1表達的影響（略）aP0.05vs陰性siRNA對照和陽性siRNA對照.A：非特異性siRNA對照；B：特異性TGFbetasiRNA1；C：特異性TGFbetasiRNA2；D：特異性TGFbetasiRNA3；M：DNAmarker.圖2RTPCR檢測TGFβ1siRNA轉(zhuǎn)染后TGFβ1mRNA表達（略）A：陰性siRNA對照；B：陽性GAPDHsiRNA對照；C：特異