rnai抑制胰腺癌細(xì)胞株vegf表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

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1、RNAi抑制胰腺癌細(xì)胞株VEGF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究作者：趙鑫,李德春,張子祥,趙華,岑建農(nóng)【關(guān)鍵詞】RNA干擾；Panc1；VEGF；PCR；ELISA　　0引言　　血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是體內(nèi)一種內(nèi)皮細(xì)胞特有的有絲分裂原，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、水解基膜和血管構(gòu)建，誘發(fā)血管期的啟動(dòng)[1，2]。RNA干擾(RNAi)是一種重要的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制[3]。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建以VEGF基因?yàn)榘邢虻腞NA干擾質(zhì)粒，沉默胰腺癌Panc1細(xì)胞株中VEGF基因的表達(dá)，為抑制胰腺癌血管生成提供基礎(chǔ)?！　?材料與方法　

2、　1.1主要材料siRNA真核表達(dá)載體pGCsi8U6/Neo/GFP和陰性對(duì)照載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司，abl、VEGF基因PCR引物及探針由上海生工公司合成；人VEGFELISA試劑盒為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品?！　?.2方法　　1.2.1pGCsiVEGF的構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染參考siRNA的設(shè)計(jì)策略，從VEGF基因第三外顯子上挑選長(zhǎng)為19個(gè)堿基的特異性寡核苷酸序列(5'GGAGTACCCTGATGAGATC3′)，合成其發(fā)卡樣兩端配對(duì)siRNA寡核苷酸鏈，中間以9個(gè)脫氧核苷酸的Loop相連。取合成

3、兩條shRNA的模板單鏈，退火形成siRNA載體插入片斷，見圖1。取空質(zhì)粒用BamHI和HindIII行雙酶切，電泳，切膠，回收線性質(zhì)粒，純化。將上述片斷接入線性化質(zhì)粒，得到重組子命名為pGCsiVEGF。對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。脂質(zhì)體法將pGCsiVEGF和陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Panc1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用含G418培養(yǎng)液篩選2周后挑取陽性單克隆繼續(xù)培養(yǎng)4周，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)篩選后的GFP表達(dá)率?！　?.2.2RealTimePCR和ELISA取轉(zhuǎn)染陽性克隆細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈。以看家基因ab

4、l的表達(dá)作為內(nèi)參，abl和VEGF的引物及Taqman探針序列如下：Abl引物：正義5′TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA3′；反義5′ACTCAGACCCTGAGGCTCAAAG3′；ablTaqman探針：5′FAM8AAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATTAMARA3′VEGF引物：正義5′GGGCCTCCGAAACCATGAACTT3′；反義5′CGCATCAGGGGCACACAG3′；VEGFTaqman探針：5′FAMCACCATGCAGATTATGC

5、GGATCAAACCTAMARA3′擴(kuò)增條件：95℃5min，95℃20s，60℃1min，采集熒光信號(hào)，50個(gè)循環(huán)。對(duì)樣本設(shè)復(fù)管檢測(cè)，取平均值作為目的基因表達(dá)水平。abl、VEGF基因拷貝數(shù)按照江蘇省血研所已建立的方法計(jì)算，以同一份樣本VEGF基因拷貝數(shù)×102/abl基因拷貝數(shù)來計(jì)算VEGF基因表達(dá)水平，將未轉(zhuǎn)染Panc1細(xì)胞（對(duì)照）設(shè)定為100%，計(jì)算出各組干擾效率。按照第219～280位堿基為插入片段序列，其中第225～271位堿基為siRNA目的片段序列圖3流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP表達(dá)率ELISA試劑

6、盒操作說明，450nm可見光比色得吸光度(A)值，作為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/m1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)本的A值得出上清液VEGF濃度。將未轉(zhuǎn)染Panc1細(xì)胞（對(duì)照）設(shè)定為100％，計(jì)算出各組相對(duì)含量?！　D1siRNA載體插入片斷序列（略）　　圖2重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定（略）　　1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。8　　2結(jié)果　　2.1重組質(zhì)粒測(cè)序表明目的片斷已克隆入載體，表示質(zhì)粒構(gòu)建成功。截取部分測(cè)序結(jié)果見圖2?！　?.2轉(zhuǎn)染陽

7、性克隆細(xì)胞GFP表達(dá)率G418篩選2周后挑取轉(zhuǎn)染陽性單克隆細(xì)胞培養(yǎng)4周，Panc1/陰性對(duì)照載體和Panc1/重組子的GFP表達(dá)率分別為90.3％、94.7％，見圖3。　　2.3RealTimePCR和ELISA結(jié)果圖4顯示VEGF基因?qū)崟r(shí)定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同實(shí)驗(yàn)間誤差＜5%。RealTimePCR和ELISA數(shù)據(jù)見表1?！　”?實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組的VEGF干擾效率及ELISA檢測(cè)VEGF表達(dá)相對(duì)含量標(biāo)本VEGF基因相對(duì)含量（略）　　注:★表示與Panc1組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.

8、01;▲表示與Negative組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01　　圖4VEGF基因?qū)崟r(shí)定量PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線（略）　　3討論8　　腫瘤血管生成對(duì)實(shí)體瘤的生長(zhǎng)起重要作用，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種重要的促血管生成因子，通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖、增加血管通透性，對(duì)腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移等發(fā)揮著重要作用。因此，有效地抑制VEGF的表達(dá)或降低其生物學(xué)活性是腫