rnai抑制胰腺癌細胞株vegf表達的實驗研究

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1、RNAi抑制胰腺癌細胞株VEGF表達的實驗研究作者：趙鑫,李德春,張子祥,趙華,岑建農【關鍵詞】RNA干擾；Panc1；VEGF；PCR；ELISA　　0引言　　血管內皮細胞生長因子(VEGF)是體內一種內皮細胞特有的有絲分裂原，調控血管內皮細胞的增殖、遷移、水解基膜和血管構建，誘發(fā)血管期的啟動[1，2]。RNA干擾(RNAi)是一種重要的轉錄后基因沉默機制[3]。本實驗擬構建以VEGF基因為靶向的RNA干擾質粒，沉默胰腺癌Panc1細胞株中VEGF基因的表達，為抑制胰腺癌血管生成提供基礎。　　1材料與方法　　1.1主要材料si

2、RNA真核表達載體pGCsiU6/Neo/GFP和陰性對照載體購自上海吉凱基因化學公司，abl、VEGF基因PCR引物及探針由上海生工公司合成；人VEGFELISA試劑盒為美國RD公司產品。　　1.2方法　　1.2.1pGCsiVEGF的構建與細胞轉染參考siRNA的設計策略，從VEGF基因第三外顯子上挑選長為19個堿基的特異性寡核苷酸序列(5'GGAGTACCCTGATGAGATC3′)，合成其發(fā)卡樣兩端配對siRNA寡核苷酸鏈，中間以9個脫氧核苷酸的Loop相連。取合成兩條shRNA的模板單鏈，退火形成siRNA載體插入

3、片斷，見圖1。取空質粒用BamHI和HindIII行雙酶切，電泳，切膠，回收線性質粒，純化。將上述片斷接入線性化質粒，得到重組子命名為pGCsiVEGF。對其進行測序。脂質體法將pGCsiVEGF和陰性對照質粒轉染Panc1細胞。轉染后的細胞用含G418培養(yǎng)液篩選2周后挑取陽性單克隆繼續(xù)培養(yǎng)4周，用流式細胞儀檢測篩選后的GFP表達率?！　?.2.2RealTimePCR和ELISA取轉染陽性克隆細胞，提取細胞內總RNA，逆轉錄合成cDNA鏈。以看家基因abl的表達作為內參，abl和VEGF的引物及Taqman探針序列如下：Ab

4、l引物：正義5′TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA3′；反義5′ACTCAGACCCTGAGGCTCAAAG3′；ablTaqman探針：5′FAMAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATTAMARA3′VEGF引物：正義5′GGGCCTCCGAAACCATGAACTT3′；反義5′CGCATCAGGGGCACACAG3′；VEGFTaqman探針：5′FAMCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTAMARA3′擴增條件：95℃5min，95℃20s，60℃1min

5、，采集熒光信號，50個循環(huán)。對樣本設復管檢測，取平均值作為目的基因表達水平。abl、VEGF基因拷貝數按照江蘇省血研所已建立的方法計算，以同一份樣本VEGF基因拷貝數×102/abl基因拷貝數來計算VEGF基因表達水平，將未轉染Panc1細胞（對照）設定為100%，計算出各組干擾效率。按照第219～280位堿基為插入片段序列，其中第225～271位堿基為siRNA目的片段序列圖3流式細胞儀檢測GFP表達率ELISA試劑盒操作說明，450nm可見光比色得吸光度(A)值，作為縱坐標，標準品濃度(pg/m1)為橫坐標，繪制標準曲線，根據

6、標本的A值得出上清液VEGF濃度。將未轉染Panc1細胞（對照）設定為100％，計算出各組相對含量?！　D1siRNA載體插入片斷序列（略）　　圖2重組質粒的測序鑒定（略）　　1.2.3統(tǒng)計學處理采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，兩均數比較的t檢驗，以P<0.05為具有統(tǒng)計學差異。　　2結果　　2.1重組質粒測序表明目的片斷已克隆入載體，表示質粒構建成功。截取部分測序結果見圖2。　　2.2轉染陽性克隆細胞GFP表達率G418篩選2周后挑取轉染陽性單克隆細胞培養(yǎng)4周，Panc1/陰性對照載體和Panc1/重組子的GFP表達率分

7、別為90.3％、94.7％，見圖3。　　2.3RealTimePCR和ELISA結果圖4顯示VEGF基因實時定量PCR檢測標準曲線，不同實驗間誤差＜5%。RealTimePCR和ELISA數據見表1?！　”?實時定量PCR檢測各組的VEGF干擾效率及ELISA檢測VEGF表達相對含量標本VEGF基因相對含量（略）　　注:★表示與Panc1組比較差異具有統(tǒng)計學意義,P<0.01;▲表示與Negative組比較差異具有統(tǒng)計學意義,P<0.01　　圖4VEGF基因實時定量PCR檢測標準曲線（略）　　3討論　　腫瘤血管生成對實

8、體瘤的生長起重要作用，血管內皮生長因子(VEGF)是一種重要的促血管生成因子，通過促進血管內皮細胞的分裂和增殖、增加血管通透性，對腫瘤的發(fā)展、轉移等發(fā)揮著重要作用。因此，有效地抑制VEGF的表達或降低其生物學活性是腫瘤抗血管生成治療的