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1、HSYA對MSCs向神經元樣細胞分化的保護作用河北北方學院基礎醫(yī)學院河北張家口075000項目來源：河北北方學院重大項目(項目編號：ZD120177)o作者簡介：宋小青(1978-),女，碩士，講師，主要研究方向為細胞牛物學通訊作者：魏會平(1966-),女，學士，教授，主要研究方向為牛物學。摘要：探討在MSCs向神經元樣細胞分化過程中，A(HSYA)能否提高BME引起的細胞毒理作用的能力及HSYA的最佳保護劑量。MSCs貼壁后分7組處理，再進行活力檢測，凋亡檢測，各組細胞的SOD和GSH比活力或相對含
2、量檢測，NSE、MAP-2及其基因的表達檢測。實驗結果表明HSYA能顯著提高細胞的相對活力、降低細胞凋亡率、并能維持細胞內較高的SOD/GSH水平，該組各測試數據均可達到Control-1的80%以上;與Control-2相比,經120mg/LHSYA保護后，分化后的神經元樣細胞存活時間明顯延長，NSE和MAP?2呈陽性表達，RT-PCR結果表明在3-7h內NSE和MAP-2的mRNA相對含量一肓呈上升趨勢。關鍵詞：羥基紅花黃色素，間充質干細胞，β■疏基乙醇【中圖分類號】R329【文獻標識碼】
3、A【文章編號】1001-5213(2016)09-0220-01MSCs可分化為心肌細胞⑴、成骨細胞［2?3］、神經元樣細胞［4?5］等；同時由于其取材方便、組織來源廣且無顯著的免疫原性［6］,己被看作是修復受損組織的“種子”細胞。木研究將初探HSYA能否提高細胞抵抗BME引起的細胞毒害作用的能力及最佳保護劑量，具體見下。1實驗材料1.1動物3-4周SD雄性大鼠，購于河北北方學院動物室。1.2藥品與試劑L—DMEM、胎牛血清及胰蛋白酶、HSYA、β■疏基乙醇、bFGF、NGF、NSE、MAP-
4、2及DAB試劑盒。1.3主要儀器安全工作柜、C02細胞培養(yǎng)箱、流式細胞儀、分光光度計、酶標儀、倒置熒光顯微鏡、低溫離心機、凝膠成像系統等。2實驗方法2.1MSCs的培養(yǎng)及鑒定無菌條件下，分離大鼠股骨，D-Hanks液沖洗后剪開股骨兩端，注射器吸取約5mL的基本培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，反復吹打后種植于25cm2的一次性培養(yǎng)瓶，置于37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于第3d首次換液，以后每隔2-3d換液1次，直至細胞融合達85%以上，用0.25%的胰酶消化后進行傳代。培養(yǎng)至第3代時，經胰酶消化制成MSCs單細胞懸液并計
5、數，利用D-Hanks(不含Ca2+、Mg2+)洗滌3次，然后分別加入10μl的CD29-PE,CD34-FITC,CD45-FITC和CD90?APC兔抗鼠單克隆抗體混勻，再用D-Hanks洗滌后經流式細胞儀進行檢測分析。2.2細胞活力及凋亡檢測取3thMSCs,貼壁后分7組處理：Control-1連續(xù)用基本培養(yǎng)基培養(yǎng)，Control-2先用基本培養(yǎng)基培養(yǎng)后，然后用預誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；5個HSYA保護組先用保護培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,然后用預誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；處理完畢后每孔加20μlMT
6、T溶液(5mg/ml),放入培養(yǎng)箱孵育4h后棄上清，每孔加入150μl的DMSO,室溫震蕩10min后放入酶標儀，在570nm波長處測OD值。取3thMSCs爬片，經含有HSYA和BME的培養(yǎng)基分別處理24h后，用PI熒光染料進行染色處理，于熒光倒置顯微鏡下進行觀并計算各組細胞的凋亡率。2.3SOD和GSH活f生檢測按照“方法2.2”分7組處理細胞并分別收集，采用反復凍融法處理所收集的細胞，研磨后加入緩沖液，按試劑盒說明書進行SOD和GSH活性測定，并通過考馬斯亮藍法進行蛋白含量標定。2.4神經分
7、化及免疫細胞化學鑒定待3thMSCs爬片生長至60-70%吋，采用含有最適HSYA保護濃度的保護培養(yǎng)基進行培養(yǎng)24h,然后加入預誘導培養(yǎng)基處理24h,最后更換為神經誘導培養(yǎng)基進行分化誘導，在分化誘導過程中要密切觀察細胞的分化情況。2.5RT-PCR檢測NSE、MAP-2基因的表達變化各引物的相關信息見表4討論HSYA具有抗氧化、清除氧自由基及抗炎癥作用等多種藥理作用，同吋其對免疫系統、心腦血管系統及神經系統均有一定的保護作用。體外將MSCs誘導分化為神經元樣細胞的方法較多，而BME+bFGF/EGF幾乎
8、成為一種經典，該方法具有誘導效率高，分化后的細胞中少有神經膠質細胞產生的優(yōu)點，但其最大的缺點是分化后的細胞存活吋間較短。本研究從增強分化前細胞的相對活力、抗氧化及抗凋亡能力等方面出發(fā)，旨在為細胞移植、基因轉染等其他實驗爭取時間。實驗結果發(fā)現，不同濃度的HSYA可不同程度地提高分化前細胞的相對活力和抗氧化力，其中以120mg/LHSYA的保護作用最為顯著,口體外HSYA確實可以提高細胞的抗凋亡能力。經120mg/LHSYA保護而分化產生的神經
