hsya對(duì)mscs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的保護(hù)作用

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1、HSYA對(duì)MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的保護(hù)作用河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院河北張家口075000項(xiàng)目來(lái)源：河北北方學(xué)院重大項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：ZD120177)o作者簡(jiǎn)介：宋小青(1978-),女，碩士，講師，主要研究方向?yàn)榧?xì)胞牛物學(xué)通訊作者：魏會(huì)平(1966-),女，學(xué)士，教授，主要研究方向?yàn)榕Ｎ飳W(xué)。摘要：探討在MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化過(guò)程中，A(HSYA)能否提高BME引起的細(xì)胞毒理作用的能力及HSYA的最佳保護(hù)劑量。MSCs貼壁后分7組處理，再進(jìn)行活力檢測(cè)，凋亡檢測(cè)，各組細(xì)胞的SOD和GSH比活力或相對(duì)含

2、量檢測(cè)，NSE、MAP-2及其基因的表達(dá)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HSYA能顯著提高細(xì)胞的相對(duì)活力、降低細(xì)胞凋亡率、并能維持細(xì)胞內(nèi)較高的SOD/GSH水平，該組各測(cè)試數(shù)據(jù)均可達(dá)到Control-1的80%以上;與Control-2相比,經(jīng)120mg/LHSYA保護(hù)后，分化后的神經(jīng)元樣細(xì)胞存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，NSE和MAP?2呈陽(yáng)性表達(dá)，RT-PCR結(jié)果表明在3-7h內(nèi)NSE和MAP-2的mRNA相對(duì)含量一肓呈上升趨勢(shì)。關(guān)鍵詞：羥基紅花黃色素，間充質(zhì)干細(xì)胞，β■疏基乙醇【中圖分類號(hào)】R329【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】

3、A【文章編號(hào)】1001-5213(2016)09-0220-01MSCs可分化為心肌細(xì)胞⑴、成骨細(xì)胞［2?3］、神經(jīng)元樣細(xì)胞［4?5］等；同時(shí)由于其取材方便、組織來(lái)源廣且無(wú)顯著的免疫原性［6］,己被看作是修復(fù)受損組織的“種子”細(xì)胞。木研究將初探HSYA能否提高細(xì)胞抵抗BME引起的細(xì)胞毒害作用的能力及最佳保護(hù)劑量，具體見下。1實(shí)驗(yàn)材料1.1動(dòng)物3-4周SD雄性大鼠，購(gòu)于河北北方學(xué)院動(dòng)物室。1.2藥品與試劑L—DMEM、胎牛血清及胰蛋白酶、HSYA、β■疏基乙醇、bFGF、NGF、NSE、MAP-

4、2及DAB試劑盒。1.3主要儀器安全工作柜、C02細(xì)胞培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀、分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、倒置熒光顯微鏡、低溫離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)等。2實(shí)驗(yàn)方法2.1MSCs的培養(yǎng)及鑒定無(wú)菌條件下，分離大鼠股骨，D-Hanks液沖洗后剪開股骨兩端，注射器吸取約5mL的基本培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，反復(fù)吹打后種植于25cm2的一次性培養(yǎng)瓶，置于37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于第3d首次換液，以后每隔2-3d換液1次，直至細(xì)胞融合達(dá)85%以上，用0.25%的胰酶消化后進(jìn)行傳代。培養(yǎng)至第3代時(shí)，經(jīng)胰酶消化制成MSCs單細(xì)胞懸液并計(jì)

5、數(shù)，利用D-Hanks(不含Ca2+、Mg2+)洗滌3次，然后分別加入10μl的CD29-PE,CD34-FITC,CD45-FITC和CD90?APC兔抗鼠單克隆抗體混勻，再用D-Hanks洗滌后經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。2.2細(xì)胞活力及凋亡檢測(cè)取3thMSCs,貼壁后分7組處理：Control-1連續(xù)用基本培養(yǎng)基培養(yǎng)，Control-2先用基本培養(yǎng)基培養(yǎng)后，然后用預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；5個(gè)HSYA保護(hù)組先用保護(hù)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,然后用預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；處理完畢后每孔加20μlMT

6、T溶液(5mg/ml),放入培養(yǎng)箱孵育4h后棄上清，每孔加入150μl的DMSO,室溫震蕩10min后放入酶標(biāo)儀，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。取3thMSCs爬片，經(jīng)含有HSYA和BME的培養(yǎng)基分別處理24h后，用PI熒光染料進(jìn)行染色處理，于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀并計(jì)算各組細(xì)胞的凋亡率。2.3SOD和GSH活f生檢測(cè)按照“方法2.2”分7組處理細(xì)胞并分別收集，采用反復(fù)凍融法處理所收集的細(xì)胞，研磨后加入緩沖液，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行SOD和GSH活性測(cè)定，并通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白含量標(biāo)定。2.4神經(jīng)分

7、化及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定待3thMSCs爬片生長(zhǎng)至60-70%吋，采用含有最適HSYA保護(hù)濃度的保護(hù)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24h,然后加入預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理24h,最后更換為神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行分化誘導(dǎo)，在分化誘導(dǎo)過(guò)程中要密切觀察細(xì)胞的分化情況。2.5RT-PCR檢測(cè)NSE、MAP-2基因的表達(dá)變化各引物的相關(guān)信息見表4討論HSYA具有抗氧化、清除氧自由基及抗炎癥作用等多種藥理作用，同吋其對(duì)免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)均有一定的保護(hù)作用。體外將MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法較多，而BME+bFGF/EGF幾乎

8、成為一種經(jīng)典，該方法具有誘導(dǎo)效率高，分化后的細(xì)胞中少有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的優(yōu)點(diǎn)，但其最大的缺點(diǎn)是分化后的細(xì)胞存活吋間較短。本研究從增強(qiáng)分化前細(xì)胞的相對(duì)活力、抗氧化及抗凋亡能力等方面出發(fā)，旨在為細(xì)胞移植、基因轉(zhuǎn)染等其他實(shí)驗(yàn)爭(zhēng)取時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的HSYA可不同程度地提高分化前細(xì)胞的相對(duì)活力和抗氧化力，其中以120mg/LHSYA的保護(hù)作用最為顯著,口體外HSYA確實(shí)可以提高細(xì)胞的抗凋亡能力。經(jīng)120mg/LHSYA保護(hù)而分化產(chǎn)生的神經(jīng)