資源描述：
《海洋低溫堿性蛋白酶的基因克隆、序列分析與結(jié)構(gòu)模建和功能的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、塑墮坐：主里塑堂盔堂堡主迨塞：壁堂堡塑熊絲絲魚壁塑薹里塞墮：堡型坌塹墨簍堂墮壁墜翌坐堂!Ⅱ翌海洋低溫堿性蛋白酶的基因克隆、序列分析及結(jié)構(gòu)模建與功能研究摘要海洋低溫堿性蛋白酶(MarineLow—temperatureAlkalineProtease，MLAP)是由一海洋桿菌—QD80產(chǎn)的一種胞外酶。本論文主要進行了海洋低溫堿性蛋白酶的克隆和生物信息學(xué)分析及其空間結(jié)構(gòu)的模建：利用末端半補齊技術(shù)構(gòu)建了海洋桿菌QDSO的基因文庫。末端半補齊技術(shù)的優(yōu)點有：(1)徹底消除載體自環(huán)化的可能性；(2)消除了插入片段自身相互連接的可能性；(3)同常用的堿性磷酸酯酶法相比較
2、，采用半補齊技術(shù)其連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率不受影響。用酪蛋白平板法和電泳圖相比較法的活性篩選方法從基因文庫中篩選到一株陽性克隆(命名為pHHl)。序列測定分析表明，此重組質(zhì)粒包含有長度為1377bp低溫堿性蛋白酶基因的完整的開放讀碼框架(ORF)和上游基因調(diào)控序列。此片段編碼由459個氨基酸組成的酶，計算分子量為49903．92Dal。通過構(gòu)建表達載體在大腸桿菌中得到了表達。利用已有的生物信息學(xué)軟件對其進行了分析。結(jié)果表明：它與銅綠假單胞菌的同源性較高，有可能是假單胞菌屬。該酶含有兩個結(jié)構(gòu)域，分別為Zincins催化結(jié)構(gòu)域和金屬蛋白酶羧基端結(jié)構(gòu)域。同源性分析表明此
3、蛋白酶含有一個避“Hx出H的基元。采用不同的模建方法對海洋低溫堿性蛋白酶進行了同源模建，然后對其模建結(jié)果進行了分析。結(jié)果表明用Gen03d預(yù)測方法得到的結(jié)果比用其它方法的模型更符合立體化學(xué)特性和生物學(xué)功能的規(guī)律。模建的結(jié)果表明此蛋白酶含有一個狹縫，底物就在此處進行催化水解反應(yīng)。同時對其低溫適應(yīng)性進行了預(yù)測，結(jié)果表明氫鍵發(fā)揮了重要作用。為了驗證堿性蛋白酶的生物信息學(xué)分析結(jié)果和模建的結(jié)果，我們對其等電點、分子量、催化性基團組氨酸以及鋅離子、鈣離子和EDTA的影響進行了實驗分析。同時對其低溫適應(yīng)性進行了驗證。結(jié)果表明模建的結(jié)果是符合酶的功能和結(jié)構(gòu)的。本結(jié)果有相當(dāng)
4、的先進性和技術(shù)創(chuàng)新性，填補了國內(nèi)在海洋低溫酶研究領(lǐng)域的一些空白，對加速開發(fā)我國海洋生物活性物質(zhì)資源有重要的理論和實際意義。關(guān)鍵詞．海洋低溫堿性蛋白酶克隆生物信息學(xué)同源模建墅蕉堡：生魚鲞鱟盔堂塑主笙鑾：查鱟堡塑墮絲曼自墮絲董里塞墮：度型坌塹墨墮塑夔堡復(fù)墊絲塑塑Cloning、sequenceanalysis、structuremodelandfunctionstudyofmarinelow—temperaturealkalineproteaseAbstractMarineLow—temperatureAlkalineProtease(MLAP)isakind
5、ofextracellularenzymefromakindofmarlnebacteriumofQDS0．Thestudymainlyconcernedaboutgeneengineering、bioinformaticsandhomologymodelingofMLAP．Thegenelibrariesconstructedbythepartiallyfilledmethods．Thismethodhasseveralstrongpoints：(1)Eliminatingthepossibilityofringingselfofvector．(2)Th
6、einsertingfragmentscan’tligateeachother．(3)Thetranslatingratewiththepartiallyfilledinmethodisequaltophosphatasemethod．Onepositiveclonewasobtainedfromthelibrarieswithcaseinflatandelectrophoresiscomparisonmethod．Analyzedthesequencingresult，thepositivecloneincludetheOpenReadFrameofML
7、APgeneandupperregulatorysequence．TheFragmentcodestheenzymeof459amideacids，themoleculeweightofwhichwas49903．92Dal．TheconstructedexpressionvectorexpressedinEcoli．TheMLAPwasanalyzedwithbioinformaticssoftware．Ithastwodomains：ZincinscatalyticdomainandC-terminaldomainofMetalloprotease．T
8、hesimilarityindicatesthatithasa‘‘
