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《海洋低溫堿性蛋白酶的基因克隆、序列分析與結(jié)構(gòu)模建和功能的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、塑墮坐：主里塑堂盔堂堡主迨塞：壁堂堡塑熊絲絲魚壁塑薹里塞墮：堡型坌塹墨簍堂墮壁墜翌坐堂!Ⅱ翌海洋低溫堿性蛋白酶的基因克隆、序列分析及結(jié)構(gòu)模建與功能研究摘要海洋低溫堿性蛋白酶(MarineLow—temperatureAlkalineProtease，MLAP)是由一海洋桿菌—QD80產(chǎn)的一種胞外酶。本論文主要進(jìn)行了海洋低溫堿性蛋白酶的克隆和生物信息學(xué)分析及其空間結(jié)構(gòu)的模建：利用末端半補(bǔ)齊技術(shù)構(gòu)建了海洋桿菌QDSO的基因文庫(kù)。末端半補(bǔ)齊技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)有：(1)徹底消除載體自環(huán)化的可能性；(2)消除了插入片段自身相互連接的可能性；(3)同常用的堿性磷酸酯酶法相比較
2、，采用半補(bǔ)齊技術(shù)其連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率不受影響。用酪蛋白平板法和電泳圖相比較法的活性篩選方法從基因文庫(kù)中篩選到一株陽(yáng)性克隆(命名為pHHl)。序列測(cè)定分析表明，此重組質(zhì)粒包含有長(zhǎng)度為1377bp低溫堿性蛋白酶基因的完整的開(kāi)放讀碼框架(ORF)和上游基因調(diào)控序列。此片段編碼由459個(gè)氨基酸組成的酶，計(jì)算分子量為49903．92Dal。通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體在大腸桿菌中得到了表達(dá)。利用已有的生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：它與銅綠假單胞菌的同源性較高，有可能是假單胞菌屬。該酶含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為Zincins催化結(jié)構(gòu)域和金屬蛋白酶羧基端結(jié)構(gòu)域。同源性分析表明此
3、蛋白酶含有一個(gè)避“Hx出H的基元。采用不同的模建方法對(duì)海洋低溫堿性蛋白酶進(jìn)行了同源模建，然后對(duì)其模建結(jié)果進(jìn)行了分析。結(jié)果表明用Gen03d預(yù)測(cè)方法得到的結(jié)果比用其它方法的模型更符合立體化學(xué)特性和生物學(xué)功能的規(guī)律。模建的結(jié)果表明此蛋白酶含有一個(gè)狹縫，底物就在此處進(jìn)行催化水解反應(yīng)。同時(shí)對(duì)其低溫適應(yīng)性進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果表明氫鍵發(fā)揮了重要作用。為了驗(yàn)證堿性蛋白酶的生物信息學(xué)分析結(jié)果和模建的結(jié)果，我們對(duì)其等電點(diǎn)、分子量、催化性基團(tuán)組氨酸以及鋅離子、鈣離子和EDTA的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析。同時(shí)對(duì)其低溫適應(yīng)性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明模建的結(jié)果是符合酶的功能和結(jié)構(gòu)的。本結(jié)果有相當(dāng)
4、的先進(jìn)性和技術(shù)創(chuàng)新性，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)在海洋低溫酶研究領(lǐng)域的一些空白，對(duì)加速開(kāi)發(fā)我國(guó)海洋生物活性物質(zhì)資源有重要的理論和實(shí)際意義。關(guān)鍵詞．海洋低溫堿性蛋白酶克隆生物信息學(xué)同源模建墅蕉堡：生魚鲞鱟盔堂塑主笙鑾：查鱟堡塑墮絲曼自墮絲董里塞墮：度型坌塹墨墮塑夔堡復(fù)墊絲塑塑Cloning、sequenceanalysis、structuremodelandfunctionstudyofmarinelow—temperaturealkalineproteaseAbstractMarineLow—temperatureAlkalineProtease(MLAP)isakind
5、ofextracellularenzymefromakindofmarlnebacteriumofQDS0．Thestudymainlyconcernedaboutgeneengineering、bioinformaticsandhomologymodelingofMLAP．Thegenelibrariesconstructedbythepartiallyfilledmethods．Thismethodhasseveralstrongpoints：(1)Eliminatingthepossibilityofringingselfofvector．(2)Th
6、einsertingfragmentscan’tligateeachother．(3)Thetranslatingratewiththepartiallyfilledinmethodisequaltophosphatasemethod．Onepositiveclonewasobtainedfromthelibrarieswithcaseinflatandelectrophoresiscomparisonmethod．Analyzedthesequencingresult，thepositivecloneincludetheOpenReadFrameofML
7、APgeneandupperregulatorysequence．TheFragmentcodestheenzymeof459amideacids，themoleculeweightofwhichwas49903．92Dal．TheconstructedexpressionvectorexpressedinEcoli．TheMLAPwasanalyzedwithbioinformaticssoftware．Ithastwodomains：ZincinscatalyticdomainandC-terminaldomainofMetalloprotease．T
8、hesimilarityindicatesthatithasa‘‘
