小鼠胚胎干細(xì)胞建系和定向神經(jīng)誘導(dǎo)分化的研究

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1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要小鼠胚胎干細(xì)胞建系與定向神經(jīng)誘導(dǎo)分化的研究專業(yè)：干細(xì)胞與組織工程導(dǎo)師：余新炳教授；BruceT．Lahn博士研究生：張嘉晴中文摘要胚胎干細(xì)胞(embryoniCstem，ES)是指由早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercellmass，ICM)分離出來(lái)并建系成功的多潛能干細(xì)胞。具有自我更新能力和多向分化潛能，能在體外無(wú)限分裂增殖，并長(zhǎng)期保持未分化狀態(tài)。可分化為全身各種類型的細(xì)胞，因具有比成體干細(xì)胞更高的增殖活性和更廣泛的分化能力，在細(xì)胞治療和組織更新領(lǐng)域具有巨大的潛力。目前，人們可以利用不同的培養(yǎng)條件將ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成不同類

2、型的細(xì)胞以作為細(xì)胞移植、組織替代，甚至器官克隆的細(xì)胞供體，為將來(lái)治療人類諸多難治性疾病提供細(xì)胞來(lái)源。此外，ES細(xì)胞還是胚胎發(fā)育機(jī)制、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生成、組織更新等科研領(lǐng)域重要的工具細(xì)胞，但目前能夠得到的小鼠ES細(xì)胞系多來(lái)自于129小鼠。而科研應(yīng)用最廣泛的是近交系C57BL／6J小鼠的ES細(xì)胞系很少見(jiàn)。神經(jīng)退行性疾病(如，帕金森，老年性癡呆，癲癇等)和神經(jīng)系統(tǒng)損傷(如中風(fēng)，腦缺血，脊髓損傷等)是多發(fā)性疾病，傳統(tǒng)的治療方法不能阻止病情的發(fā)展，二十世紀(jì)九十年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)中山大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要移植可以

3、替代死亡或退變的神經(jīng)元，移植后可明顯改善上述疾病的臨床癥狀。這一成果對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和退行性疾病的治療具有劃時(shí)代的意義。一系列的動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞替代治療是治療以功能神經(jīng)元減少或損傷為特點(diǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種理想的手段。但目前這種方法要應(yīng)用到臨床還受到多方面的限制，其中最主要的是細(xì)胞來(lái)源嚴(yán)重不足。人們?cè)焉窠?jīng)干細(xì)胞視為中樞神經(jīng)系統(tǒng)移植和替代治療的理想材料，但是目前已有的研究顯示，NSCs在體外擴(kuò)增的能力有限，而且隨著傳代次數(shù)的增加，分化能力和增殖能力下降。且無(wú)論胎兒還是成體的神經(jīng)干細(xì)胞均來(lái)源稀少。而ES細(xì)胞可在體外無(wú)限增殖且能分化為任何成體細(xì)

4、胞，包括神經(jīng)細(xì)胞。因此，ES細(xì)胞向神經(jīng)方向誘導(dǎo)分化成為目前科學(xué)研究的熱點(diǎn)課題。目前，對(duì)ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干／祖細(xì)胞的研究很多，但多數(shù)誘導(dǎo)方法不成熟，ES細(xì)胞生成NSCs產(chǎn)率和純度不高，ES細(xì)胞分化產(chǎn)物還是由多種細(xì)胞成分組成。而細(xì)胞移植要求大量高純度的神經(jīng)細(xì)胞。為此，本課題首先建立C57BL／6J小鼠ES細(xì)胞系，并利用胎鼠來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)液作為主要誘導(dǎo)劑，探討一種新的、簡(jiǎn)單高效的誘導(dǎo)方法，為臨床細(xì)胞替代治療提供大量的高純度的神經(jīng)細(xì)胞。全文包括三個(gè)部分：第1部分小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立和鑒定1．目的建立C57BL／6J近交系和C57BL／

5、6J／129雜交小鼠ES系，摸索穩(wěn)定可靠的ES細(xì)胞建系技術(shù)，并對(duì)獲得的ES細(xì)胞系進(jìn)行鑒定，為下一步誘導(dǎo)分化的研究提供可靠的工具細(xì)胞。中山大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要2．方法制備胎鼠成纖維母細(xì)胞(mouseembryonicfibroblast，MEF)作為飼養(yǎng)層細(xì)胞備用。促排卵3．5周齡雌性C57BL／6J小鼠，并與成年C57BL／6J或129雄鼠交配。在交配后3．5天，處死后打開(kāi)腹腔，分離子宮，從兩側(cè)子宮角沖出囊胚，收集并放入有ES培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。3．5天后，從貼壁生長(zhǎng)的囊胚中挑出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercellmass，ICM)消化后，種入新鮮

6、的ES培養(yǎng)液。隨后鏡下觀察待飼養(yǎng)層細(xì)胞上出樣克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密地聚集在一起的圓形或橢圓形細(xì)胞團(tuán)，即為ES細(xì)胞，常規(guī)傳代培養(yǎng)即獲得ES細(xì)胞株。對(duì)所得ES細(xì)胞株進(jìn)行堿性磷酸酶染色、SSEA．1和Oct．4表達(dá)檢測(cè)以及體內(nèi)分化能力和核形分析。用攜帶綠色熒光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)基因的lentviral病毒，轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293，獲取病毒上清，用病毒上清感染SCl002ES細(xì)胞．進(jìn)行GFP基因標(biāo)記。3．結(jié)果所得4株ES細(xì)胞分別來(lái)自C57BL／6J和C57BL／6J×129雜交小鼠囊胚，各2株，命名為SCl001，SC

7、l002，SCl003，SCl004．4株ES細(xì)胞堿性磷酸酶染色均呈陽(yáng)性，免疫組化和RT-PCR檢測(cè)Oct一4均顯著表達(dá)。SSEA．1染色陽(yáng)性。體內(nèi)分化能力檢測(cè)表明，四株ES細(xì)胞均具有形成畸胎瘤的能力，鏡下觀察由三胚層細(xì)胞組成。核型分析均為二倍體：40，XY。攜帶GFP基因的lentivirus轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞成功，獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的ES細(xì)胞。4．結(jié)論獲得四株ES細(xì)胞分別來(lái)自C57BL／6J和C57BL／6J×129雜交小鼠囊胚，各中山大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要2株，命名為SCl001，SCl002，SCl003，SCl004。該細(xì)胞株均符合所

8、有胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性。第2部分小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及長(zhǎng)期擴(kuò)增體系的建立1．目的改進(jìn)目前常用的分離培養(yǎng)