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《枯草芽孢桿菌s44菌株itud基因克隆、表達及其脂肽類抗生素生物活性研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、分類號：密級：無學號：2009107060單位代碼：10759石河子大學碩士學位論文枯草芽孢桿菌S44菌株ituD基因克隆、表達及其脂肽類抗生素生物活性研究學位申請人任娟指導教師趙思峰教授申請學位類別農(nóng)學碩士專業(yè)名稱植物病理學綠洲農(nóng)業(yè)微生態(tài)多樣性與研究方向生物防治所在學院農(nóng)學院中國〃新疆〃石河子2012年6月CloningandExpressionofituDGeneandstudytobioactivityofLipopeptideAntibioticsfromBacillussubtilisS44
2、ADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByRENJUAN(PlantPathology)DissertationSupervisor:Prof.ZhaoSifengJune,2012石河子大學學位論文獨創(chuàng)性聲明及使用授權聲明學位論文獨創(chuàng)性聲明本人所呈交的學位論文是在我導師的指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，
3、除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含其他個人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中作了明確的說明并表示謝意。研究生簽名：時間：年月日使用授權聲明本人完全了解石河子大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，學校有權保留學位論文并向國家主管部門或指定機構(gòu)送交論文的電子版和紙質(zhì)版。有權將學位論文在學校圖書館保存并允許被查閱。有權將學位論文的內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)進行檢索。有權將學位論文的標題和摘要匯編出版。保密的學位論文在解密后適用本規(guī)定。研究生簽名：時間：年月日導師簽名：時間：
4、年月日摘要目的：為了明確枯草芽孢桿菌S44防治植物病害及抑制病原菌生長的機理，通過特異性引物PCR擴增技術克隆ituD基因，并對ituD基因進行了原核表達。明確枯草芽孢桿菌S44產(chǎn)IturinA。通過進一步發(fā)酵提取與該基因密切相關的脂肽類粗提物，對其抑菌活性、理化性質(zhì)、作用機制及發(fā)酵工藝進行研究，進而提高脂肽類抗生素的產(chǎn)量，最終使枯草芽孢桿菌S44發(fā)揮更好的防病效能。方法：通過特異性引物PCR擴增技術進行ituD基因的克隆與原核表達；通過濃鹽酸沉淀、甲醇抽提法提取iturin粗提物，采用平皿對峙法測定
5、其抑菌活性及理化性質(zhì)，并觀測粗提物對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響；通過單因素實驗和響應面分析相結(jié)合的統(tǒng)計方法優(yōu)化獲iturin粗提物最大產(chǎn)量的發(fā)酵工藝。研究結(jié)果如下：結(jié)果：1、本研究通過特異性引物PCR擴增技術克隆了枯草芽孢桿菌S44菌株ituD基因，序列分析表明，該基因全長為1203bp，編碼400個氨基酸，與已報道的ituD氨基酸序列同源性為85%。同時構(gòu)建了原核生物表達載體pET28a（+）-ituD，對不同的IPTG誘導濃度和誘導時間等條件的優(yōu)化結(jié)果表明，37℃6h能誘導ituD融合蛋白的最
6、大量表達,在0.5mmol/LIPTG濃度下可以成功表達出ituD蛋白。為進一步研究其表達蛋白的生物學機制、功能及其與iturinA的合成奠定基礎。2、通過甲醇抽提法獲得脂肽粗提物，用平皿對峙法分別檢測枯草芽孢桿菌S44的iturins粗提物對番茄早疫病菌、大豆立枯絲核菌、棉花黃萎病菌、西瓜枯萎病菌及瓜果腐霉病菌5種供試病原菌的抑菌活性。結(jié)果表明，該粗提物對番茄早疫病菌的抑菌效果最好，對西瓜枯萎病菌、大豆立枯病菌及棉花黃萎病菌次之。3、枯草芽孢桿菌S44的iturins粗提物在紫外燈下分別照射1h、2
7、h和4h及在自然光下照射3h、6h和12h；在60℃、80℃、100℃（電熱恒溫水槽內(nèi)進行）、121℃（高壓鍋內(nèi)進行）條件下處理30min，表現(xiàn)出了良好的耐受紫外線照射和耐熱性。iturins粗提物在pH范圍以及乙醚、異丙醇、乙酸乙酯、丙酮和氯仿5種有機溶劑處理條件下表現(xiàn)出了很好的酸堿穩(wěn)定性和耐有機溶劑的特性；該粗提物對蛋白酶K處理不敏感。上述特征進一步表明該粗提物為一種脂肽類物質(zhì)。4、隨著稀釋倍數(shù)的增大，粗提物抑菌活性逐漸降低，稀釋64倍后，粗提物抑菌效果不明顯。用粗提物處理的番茄早疫菌菌絲形態(tài)變化
8、顯著，菌絲斷裂、頂端膨大、腫脹畸形；細胞膜破裂、原生質(zhì)釋放；粗提物對孢子具有強烈的抑制作用，孢子變畸形，抑制孢子萌發(fā)。5、將iturins粗提物純化，經(jīng)反相HPLC與標準品進行比對，結(jié)果顯示樣品的主峰與標準品IturinA的一特征峰保留時間基本一致，因此樣品含有IturinA的組分。6、用PD、PS、YPG和Landy四種不同培養(yǎng)基發(fā)酵枯草芽孢桿菌S44，初步確定采I用PD和YPG培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中脂肽粗提物產(chǎn)量較高，對番茄早疫病菌、大豆立枯絲核菌、
