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《枯草芽孢桿菌s44菌株itud基因克隆、表達(dá)及其脂肽類抗生素生物活性研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、分類號：密級：無學(xué)號：2009107060單位代碼：10759石河子大學(xué)碩士學(xué)位論文枯草芽孢桿菌S44菌株ituD基因克隆、表達(dá)及其脂肽類抗生素生物活性研究學(xué)位申請人任娟指導(dǎo)教師趙思峰教授申請學(xué)位類別農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)名稱植物病理學(xué)綠洲農(nóng)業(yè)微生態(tài)多樣性與研究方向生物防治所在學(xué)院農(nóng)學(xué)院中國〃新疆〃石河子2012年6月CloningandExpressionofituDGeneandstudytobioactivityofLipopeptideAntibioticsfromBacillussubtilisS44
2、ADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByRENJUAN(PlantPathology)DissertationSupervisor:Prof.ZhaoSifengJune,2012石河子大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明及使用授權(quán)聲明學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人所呈交的學(xué)位論文是在我導(dǎo)師的指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，
3、除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含其他個人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中作了明確的說明并表示謝意。研究生簽名：時間：年月日使用授權(quán)聲明本人完全了解石河子大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并向國家主管部門或指定機(jī)構(gòu)送交論文的電子版和紙質(zhì)版。有權(quán)將學(xué)位論文在學(xué)校圖書館保存并允許被查閱。有權(quán)將學(xué)位論文的內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索。有權(quán)將學(xué)位論文的標(biāo)題和摘要匯編出版。保密的學(xué)位論文在解密后適用本規(guī)定。研究生簽名：時間：年月日導(dǎo)師簽名：時間：
4、年月日摘要目的：為了明確枯草芽孢桿菌S44防治植物病害及抑制病原菌生長的機(jī)理，通過特異性引物PCR擴(kuò)增技術(shù)克隆ituD基因，并對ituD基因進(jìn)行了原核表達(dá)。明確枯草芽孢桿菌S44產(chǎn)IturinA。通過進(jìn)一步發(fā)酵提取與該基因密切相關(guān)的脂肽類粗提物，對其抑菌活性、理化性質(zhì)、作用機(jī)制及發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，進(jìn)而提高脂肽類抗生素的產(chǎn)量，最終使枯草芽孢桿菌S44發(fā)揮更好的防病效能。方法：通過特異性引物PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行ituD基因的克隆與原核表達(dá)；通過濃鹽酸沉淀、甲醇抽提法提取iturin粗提物，采用平皿對峙法測定
5、其抑菌活性及理化性質(zhì)，并觀測粗提物對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響；通過單因素實驗和響應(yīng)面分析相結(jié)合的統(tǒng)計方法優(yōu)化獲iturin粗提物最大產(chǎn)量的發(fā)酵工藝。研究結(jié)果如下：結(jié)果：1、本研究通過特異性引物PCR擴(kuò)增技術(shù)克隆了枯草芽孢桿菌S44菌株ituD基因，序列分析表明，該基因全長為1203bp，編碼400個氨基酸，與已報道的ituD氨基酸序列同源性為85%。同時構(gòu)建了原核生物表達(dá)載體pET28a（+）-ituD，對不同的IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間等條件的優(yōu)化結(jié)果表明，37℃6h能誘導(dǎo)ituD融合蛋白的最
6、大量表達(dá),在0.5mmol/LIPTG濃度下可以成功表達(dá)出ituD蛋白。為進(jìn)一步研究其表達(dá)蛋白的生物學(xué)機(jī)制、功能及其與iturinA的合成奠定基礎(chǔ)。2、通過甲醇抽提法獲得脂肽粗提物，用平皿對峙法分別檢測枯草芽孢桿菌S44的iturins粗提物對番茄早疫病菌、大豆立枯絲核菌、棉花黃萎病菌、西瓜枯萎病菌及瓜果腐霉病菌5種供試病原菌的抑菌活性。結(jié)果表明，該粗提物對番茄早疫病菌的抑菌效果最好，對西瓜枯萎病菌、大豆立枯病菌及棉花黃萎病菌次之。3、枯草芽孢桿菌S44的iturins粗提物在紫外燈下分別照射1h、2
7、h和4h及在自然光下照射3h、6h和12h；在60℃、80℃、100℃（電熱恒溫水槽內(nèi)進(jìn)行）、121℃（高壓鍋內(nèi)進(jìn)行）條件下處理30min，表現(xiàn)出了良好的耐受紫外線照射和耐熱性。iturins粗提物在pH范圍以及乙醚、異丙醇、乙酸乙酯、丙酮和氯仿5種有機(jī)溶劑處理條件下表現(xiàn)出了很好的酸堿穩(wěn)定性和耐有機(jī)溶劑的特性；該粗提物對蛋白酶K處理不敏感。上述特征進(jìn)一步表明該粗提物為一種脂肽類物質(zhì)。4、隨著稀釋倍數(shù)的增大，粗提物抑菌活性逐漸降低，稀釋64倍后，粗提物抑菌效果不明顯。用粗提物處理的番茄早疫菌菌絲形態(tài)變化
8、顯著，菌絲斷裂、頂端膨大、腫脹畸形；細(xì)胞膜破裂、原生質(zhì)釋放；粗提物對孢子具有強(qiáng)烈的抑制作用，孢子變畸形，抑制孢子萌發(fā)。5、將iturins粗提物純化，經(jīng)反相HPLC與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對，結(jié)果顯示樣品的主峰與標(biāo)準(zhǔn)品IturinA的一特征峰保留時間基本一致，因此樣品含有IturinA的組分。6、用PD、PS、YPG和Landy四種不同培養(yǎng)基發(fā)酵枯草芽孢桿菌S44，初步確定采I用PD和YPG培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中脂肽粗提物產(chǎn)量較高，對番茄早疫病菌、大豆立枯絲核菌、
